劉曉東，熊伯立，杜元釗，王小龍，楊旭兵，馬振乾，劉紅祥，張學(xué)偉，朱小麗，高 豐

（1. 吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130012；2. 青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266000；3. 上杭縣蛟洋鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，福建上杭 364204；4. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建福州 350000）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRS virus，PRRSV）引起的一種高度接觸性傳染病，臨床上主要以各年齡豬的呼吸道癥狀和妊娠母豬晚期流產(chǎn)、早產(chǎn)，產(chǎn)弱仔、死胎或木乃伊胎為特征。我國(guó)PRRS疫情于1995年底首先發(fā)生在華北地區(qū)的規(guī)?；i場(chǎng)，繼而短時(shí)間內(nèi)迅速傳遍全國(guó)。自2006年以來(lái)，我國(guó)又出現(xiàn)了高致病性PRRSV，并對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。

GP5是PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，屬于病毒的囊膜糖蛋白，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生具有保護(hù)作用的中和抗體，并在病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和識(shí)別細(xì)胞表面受體等方面發(fā)揮著極其重要的生物學(xué)功能。美洲型和歐洲型毒株的GP5蛋白分別為200和201個(gè)氨基酸，含有2～4個(gè)糖基化位點(diǎn)和一段31個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。GP5蛋白具有較好的免疫原性，且其誘導(dǎo)的中和抗體出現(xiàn)之后，抗血清主要識(shí)別GP5蛋白。有研究表明，抗GP5抗體的效價(jià)跟血清對(duì)病毒的中和作用呈正相關(guān)[2]。本研究通過對(duì)2015-2017年所分離的PRRSVGP5基因序列進(jìn)行分析，為當(dāng)前PRRS防疫及研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒樣品

2015-2017年全國(guó)15省份58株P(guān)RRSV感染的臨床樣品。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒：購(gòu)于TAKARA公司；高保真反轉(zhuǎn)錄（RT）試劑盒：購(gòu)于羅氏公司；LATaq DNA聚合酶：購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 檢測(cè)與測(cè)序

按照文獻(xiàn)[3]介紹的RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。利用病毒RNA提取試劑盒提取總RNA，用RT試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。ORF5引物為：

上游：CATTTCATACACCTGAGACCAT；下游：AGATCATATATCATCACTGGCT。

反應(yīng)條件為：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min；94 ℃15 s，54 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，共 32 個(gè)循環(huán)，68 ℃延長(zhǎng)10 min；15 g/L 凝膠電泳，150 V，25 min。將RT-PCR產(chǎn)物送大連寶生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 分子進(jìn)化分析

利用序列分析軟件DNA star Lasergene，對(duì)所選毒株ORF5基因進(jìn)行序列比對(duì)，分析其同源性，利用MEGA6軟件制作進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR檢測(cè)

對(duì)所檢測(cè)樣品GP5基因進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，檢測(cè)到773 bp的目的條帶，表明所檢樣品均為PRRSV（圖1）。

圖1 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2 分離毒株與代表毒株進(jìn)化樹

對(duì)58株野毒株GP5基因進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，以VR2332 MLV為代表的第一亞群有6株，以TJ2006/JXA12006/HUN42008為代表的第四亞群35株，以NADC30為代表的第五亞群11株，新亞群6株，沒有分離到以CH1R/CH1A為代表的第二亞群，以及以HB1/HB2為代表的第三亞群毒株（圖2）。

2.3 分離毒株與標(biāo)準(zhǔn)毒株間核苷酸及氨基酸同源性分析

將分離的野毒株核苷酸與標(biāo)準(zhǔn)毒株核苷酸，通過DNASTAR進(jìn)行同源性對(duì)比發(fā)現(xiàn)：與第一亞群在同一分支的6株野毒株與第一亞群同源性為93.7%～99.3%，與其他亞群同源性為83.1%～91.4%；與第四亞群在同一分支的35株野毒株與第四亞群同源性為94.9%～99.7%，與其他亞群同源性為83.3%～94.4%；與NADC30為代表的第五亞群在同一分支的11株野毒與第五亞群同源性為94.2%～99.7%，與其他亞群同源性為82.3%～90.2%；6株新亞群之間的同源性為93.7%～99.2%，與其他亞群同源性為82.1%～85.6%。

圖2 PRRSV分離株遺傳進(jìn)化樹

氨基酸對(duì)比發(fā)現(xiàn)：6株第一亞群野毒株與代表毒株VR2332同源性為92.8%～98.9%，與其他亞群同源性為81.8%～89.3%；第四亞群的35株野毒與代表毒株TJ-F92、JXA1等同源性為93.1%～99.4%，與其他亞群同源性為82.7%～95.1%；11株第五亞群與代表毒株NADC30同源性為94.1%～98.9%，與其他亞群同源性為81.3%～89.1%；新亞群6株野毒之間同源性為93.2%～97.85%，與其他亞群同源性為81.6%～85.3%。

2.4 氨基酸序列進(jìn)化分析

與PRRSV GP5相關(guān)的毒力位點(diǎn)為氨基酸第13和151位[4-5]。以VR2332為代表的第一亞群毒株毒力位點(diǎn)為R13、R151，以CH1R為代表的第二亞群毒株毒力位點(diǎn)為R13、R151，以HB-2為代表的第三亞群毒株毒力位點(diǎn)為R13-Q13，以JXA1/TJ2006為代表的第四亞群毒株毒力位點(diǎn)為R13、R151，以NADC30為代表的第五亞群毒株毒力位點(diǎn)為Q13、K151。分離的第一亞群6株野毒株中，有2株（YN-1509/HeNXX-1704）的第13位點(diǎn)為Q13，其他均為R13；第四亞群的35株野毒株的第13位點(diǎn)均為R13；第五亞群11株野毒株的第13位點(diǎn)，除HeB-JZ-1610為P13外，其他均為Q13；6株新亞群野毒中，F(xiàn)JSM-1705為R13，F(xiàn)J-15091/gx-15-11/gx-yl-1504為Q13，JX-1705/SH-1705為P13。6株分離的第一亞群毒株氨基酸151位點(diǎn)中，HENXX為G151，其他為R151；第四亞群中，11株為R151，其他為K151；分離的11株第五亞群毒株中，F(xiàn)JZZ-1609為R151，其他為K151；分離的6株新亞群均為K151。

PRRSV氨基酸序列的中和表位是位于第37～44位的SH（F/L）QLIYN，其中F/L39為中和抗體的表達(dá)位點(diǎn)[6]。以VR2332毒株為代表的第一亞群為L(zhǎng)39，以CH1R毒株為代表的第二亞群為F39，以HB-2毒株為代表的第三亞群為F39，以TJ2006/JXA1、HUN4毒株為代表的第四亞群為I39，以NADC30毒株為代表的第五亞群為L(zhǎng)39。2015-2017年所分離的58株野毒株中，6株第一亞群野毒株的中和抗體位點(diǎn)為L(zhǎng)39，35株第四亞群野毒株中和抗體位點(diǎn)為I39，11株第五亞群中和抗體的位點(diǎn)為L(zhǎng)39，6株新亞群中和抗體的位點(diǎn)為S39。

對(duì) 于 3個(gè) N-糖 基 化 位 點(diǎn)（N33、N44和N51），N33有變化，N44與N51沒有變化。標(biāo)準(zhǔn)毒株中，第一亞群為N33，第二亞群為N34，第三亞群N34，第四亞群中的代表毒株均為N34N35，第五亞群的代表毒株均為N34S35。2015-2017年分離的毒株中，有6株為第一亞群，其中SDLY-1706/SDYT-1706第33位點(diǎn)為S33，其他4株為N33。35株第四亞群中，LNSY-1708/JL-16/YNKM-1707/SDDY-1612為S35，其他31株為N35；第34位點(diǎn)變化較大的有N34、G34、S34。11株第五亞群中，第34、35位氨基酸位點(diǎn)均為N34S35。6株第六亞群中第33、34、35位氨基酸位點(diǎn)均為G33N34S35（圖3）。

圖3 2015-2017年分離PRRSV株氨基酸分析

3 討論

自2006年江西省暴發(fā)高致病性PRRS疫情[1]后，PRRSV由于感染壓力及自然選擇，其基因序列不斷發(fā)生變異和重組，從而使該病防控成為難題。目前有效的疫苗免疫仍是防治PRRS的最有效手段。PRRSVGP5基因編碼的蛋白是PRRSV主要的免疫原性蛋白，是刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的重要蛋白。在2015-2017年分離的58株P(guān)RRSV毒株中，有6株屬于以VR2332為代表的第一亞群，35株屬于以JXA1/TJM-F92為代表的第四亞群，11株屬于NADC30為代表的第五亞群，6株屬于新亞群。由此可以發(fā)現(xiàn)，我國(guó)PRRSV毒株存在易變異和多樣性等特點(diǎn)，并且所分離毒株并沒有嚴(yán)格的地域差異，這為PRRS的防疫帶來(lái)了更大挑戰(zhàn)。

囊膜糖蛋白GP5在PRRSV感染的細(xì)胞內(nèi)雖然表達(dá)水平較低，但它卻是主要的免疫原性蛋白。在不同毒株間，GP5蛋白是各結(jié)構(gòu)蛋白中變異最大的[7]，其氨基酸位點(diǎn)變化可以改變中和抗體效果。在2015-2017年所分離的58株野毒株中，6株第一亞群野毒株中和抗體位點(diǎn)為L(zhǎng)39，35株第四亞群野毒株中和抗體位點(diǎn)為I39，11株第五亞群中和抗體位點(diǎn)為L(zhǎng)39，6株新亞群中和抗體的位點(diǎn)為S39。由此可推斷中和表位在不斷變化并逐步變異。GP5蛋白一些主要位點(diǎn)的變異并無(wú)地域性差

異，隨著時(shí)間的推移和基因亞型的改變，中和保護(hù)位點(diǎn)也在不斷發(fā)生變化。從2015-2017年的分離株基因分析來(lái)看，GP5蛋白第151位毒力位點(diǎn)發(fā)生的變化較大，由第一亞群R151向第六亞群K151轉(zhuǎn)變，這與李廣興[8]等的研究一致。野毒株R151變異主要影響PRRSV中和抗體抑制病毒的效果，但關(guān)于病毒毒力的影響尚未見報(bào)道[4]。由此推測(cè)，不同地方分離毒株間存在一定的毒力差異；GP5蛋白第151位毒力位點(diǎn)的不同導(dǎo)致不同亞群GP5抗體抑制PRRSV的能力存在差異。關(guān)于3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)（N33、N44和N51）的變化，N33變化較大，而N44與N51則沒有變化。由此推斷，N-糖鏈糖基化位點(diǎn)也在變異，但是這個(gè)突變是否影響病毒毒力，有待進(jìn)一步證實(shí)。

4 結(jié)論

通過以上結(jié)果可以得出以下結(jié)論：我國(guó)PRRSV毒株呈多亞群共存，不同亞群毒株毒力及中和保護(hù)位點(diǎn)存在差異，同一亞群毒株毒力及保護(hù)位點(diǎn)也有差異。這些基因序列的變化為該病防疫帶來(lái)了較大壓力。因此，針對(duì)PRRS防控，必須進(jìn)行田間毒株的檢測(cè)和基因分析，然后選擇相應(yīng)基因型毒株疫苗進(jìn)行免疫，切勿盲目選擇疫苗，以免造成經(jīng)濟(jì)損失。

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