何 丹，楊 林，秦少容，張景勍

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400016;2.重慶市食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 401121;3.太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠(chǎng)有限公司，重慶 408000)

藿香正氣口服液是由蒼術(shù)、陳皮、厚樸、生半夏等共十味中藥組成的復(fù)方口服制劑，具有解表化濕，理氣和中之功效。用于外感風(fēng)寒、內(nèi)傷濕滯，夏傷暑濕，頭痛昏重，脘腹脹痛，嘔吐泄瀉，胃腸型感冒［1］。目前對(duì)藿香正氣制劑的定量測(cè)定多見(jiàn)于采用HPLC法對(duì)厚樸酚、和厚樸酚、陳皮苷及百秋李醇進(jìn)行測(cè)定［2-5］，還未見(jiàn)藿香正氣口服液中核苷類(lèi)成分量測(cè)定的報(bào)道。核苷類(lèi)成分是半夏藥材中含有量較高的活性成分之一，藥理活性明確，且核苷類(lèi)成分含有量的高低是判別半夏藥材及飲片質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要依據(jù)［6］，也直接影響到制劑的藥效。目前關(guān)于中藥材及中成藥中核苷類(lèi)成分的測(cè)定方法的文獻(xiàn)報(bào)道主要是采用 HPLC法［7-9］，未見(jiàn)采用UPLC法。本實(shí)驗(yàn)采用 UPLC(Ultra Performance Liquid Chromatography)法同時(shí)對(duì)藿香正氣口服液中的尿苷、鳥(niǎo)苷及腺苷進(jìn)行測(cè)定。該方法高效、快速，重復(fù)性和精密度良好，適用于藿香正氣口服液中3種核苷類(lèi)成分的測(cè)定。

1 儀器與試藥

Waters ACQUITY UPLC;藿香正氣口服液(批號(hào)11111571、11111896、11111902，太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠(chǎng));尿苷對(duì)照品(批號(hào)100635-200401，中國(guó)食品藥品檢定研究院);鳥(niǎo)苷對(duì)照品(批號(hào)E-0575，上海同田生物有限公司);腺苷對(duì)照品(批號(hào)110879-200202，中國(guó)食品藥品檢定研究院)。甲醇為色譜純(山東禹王實(shí)業(yè)總公司化工廠(chǎng))，實(shí)驗(yàn)用水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH Cl8色譜柱(1.7μm，2.1 mm×50 mm);柱溫30℃;流動(dòng)相為水-甲醇按表1梯度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm;體積流量0.5 mL/min;進(jìn)樣量5μL，理論塔板數(shù)按尿苷峰計(jì)算不低于2000。

表1 梯度洗脫Tab.1 Mobile phase gradient elution

2.2 對(duì)照品貯備液的制備 精密稱(chēng)取尿苷對(duì)照品0.02058 g、鳥(niǎo)苷對(duì)照品0.01146 g和腺苷對(duì)照品0.01006 g，置100 mL量瓶中，加少量甲醇溶解，加水稀釋至刻度，搖勻。得尿苷為205.8μg/mL、鳥(niǎo)苷為114.6μg/mL、腺苷為100.6μg/mL的混合對(duì)照品貯備液。

2.3 供試品溶液的制備 取批號(hào)為11111571、11111896和11111902的藿香正氣口服液適量，0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

3 結(jié)果

3.1 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密量取混合對(duì)照品貯備液0.5、0.8、1、2、4、5 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得系列混合對(duì)照品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積Y對(duì)質(zhì)量濃度X(μg/mL)進(jìn)行線(xiàn)性回歸。尿苷的回歸方程為Y=87703X－3811(r=0.9999);鳥(niǎo)苷的回歸方程為Y=60604X－1478(r=0.9999);腺苷的回歸方程為Y=61913X－524(r=0.9999)。結(jié)果表明，尿苷在10.29～102.9μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系;鳥(niǎo)苷在5.73～57.3μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系;腺苷在5.03～50.3μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

3.2 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下方法連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果尿苷、鳥(niǎo)苷和腺苷的RSD分別為0.34%、0.35%和0.36%。符合精密度試驗(yàn)要求。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，室溫下放置0、1、2、4、6、8 h，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣5μL測(cè)定峰面積。結(jié)果峰面積基本不變，尿苷、鳥(niǎo)苷和腺苷的RSD分別為0.31%、0.33%和0.32%，表明溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為11111571藿香正氣口服液，按供試品配制方法平行配制6份，按2.1項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，尿苷、鳥(niǎo)苷和腺苷的平均質(zhì)量濃度分別為38.33μg/mL、23.40μg/mL 和 27.48 μg/mL，RSD 分 別 為1.45%、1.19%和0.98%。

3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量的藿香正氣口服液，精密量取5 mL，共27份，置10 mL量瓶中，分別精密加入相當(dāng)于制劑中尿苷、鳥(niǎo)苷和腺苷含有量的80%、100%和120%的混合對(duì)照貯備液，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣5μL，按外標(biāo)法計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2～4。結(jié)果尿苷、鳥(niǎo)苷和腺苷的平均回收率分別為97.25%、98.34%和98.88%，RSD分別為2.46%、2.18%和1.89%。

表2 尿苷回收率Tab.2 Results of recovery tests for uridine

表3 鳥(niǎo)苷回收率Tab.3 Results of recovery tests for guanosine

表4 腺苷回收率Tab.4 Results of recovery tests for adenosine

3.6 樣品測(cè)定 3批樣品按供試品配制方法配制，按2.1項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析，計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表5，色譜圖見(jiàn)圖1。

表5 藿香正氣口服液測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.5 Determination results of Huoxiang Zhengqi Qral Liquid(n=3)

圖1 藿香正氣口服液測(cè)定色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of Huoxiang Zhengqi Oral Liquid

4 討論

超高效液相色譜技術(shù)采用1.7μm顆粒度色譜柱填料，與傳統(tǒng)的5.0μm顆粒度的色譜柱填料的HPLC技術(shù)相比能獲更高的柱效，并且在更寬的線(xiàn)速度范圍內(nèi)柱保持恒定，因而有利于提高流動(dòng)相速度，縮短分析時(shí)間，提高分析通量［10］。同時(shí)可顯著改善色譜峰的分離度和檢測(cè)靈敏度，特別適用于中藥指紋圖譜研究和中藥復(fù)方制劑多成分的分析測(cè)定［11-15］，已成為繼HPLC后現(xiàn)代分析的重要手段。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，UPLC法測(cè)定藿香正氣口服液中核苷類(lèi)成分分離效果好，方法準(zhǔn)確可靠。

《中國(guó)藥典》2010年版中藿香正氣口服液中含量測(cè)定項(xiàng)規(guī)定對(duì)厚樸酚與和厚樸酚和橙皮苷進(jìn)行測(cè)定，作為質(zhì)量控制指標(biāo)［1］。本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)甲醇比例增加后洗脫出的成分較多，在下一步研究工作中可同時(shí)測(cè)定以上成分。

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