馬媛媛，華 偉

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院藥物臨床試驗機(jī)構(gòu)，上海 200032;2.山東華信制藥集團(tuán)股份有限公司，山東菏澤 274009)

柴胡為傘形科柴胡屬植物部分種類的根或全草，《中國藥典》2000年版收載了北柴胡和南柴胡(狹葉柴胡)兩個種。柴胡藥材中主要成分有柴胡皂苷、植物甾醇、側(cè)金盞花醇、揮發(fā)油、多糖、黃酮類、木脂素類、香豆素類等成分［1］。主要有解熱［2］、鎮(zhèn)痛［3］、抗炎［4］、降血脂［5］和抗病毒等藥理作用，秦漢時期，柴胡已經(jīng)開始應(yīng)用于臨床，在馬王堆漢幕帛書《五十二病方》中，就有單味柴胡煎服治療頭痛的記載［6-7］。

柴胡注射液為部頒標(biāo)準(zhǔn)《中藥成方制劑》第十七冊收載的品種。是由柴胡的干燥根，經(jīng)水蒸氣蒸餾制成的滅菌水溶液［8］，主要為水飽和的揮發(fā)油。柴胡注射液是治療上呼吸道感染、風(fēng)寒感冒和發(fā)熱的常用藥物［9］。部頒標(biāo)準(zhǔn)中柴胡注射液無定量測定項。而一般的性狀鑒別和理化鑒別只能從中藥及其制劑的外觀和個別活性成分進(jìn)行質(zhì)量控制，再加上其化學(xué)成分復(fù)雜，有效成分含有量相差懸殊，造成了柴胡及其制劑質(zhì)量不穩(wěn)定［10］。對柴胡質(zhì)量控制方法的研究報道很多，但定量分析指標(biāo)只局限在柴胡皂苷［11］等個別成分上，無法對中藥材及其制劑進(jìn)行全面而準(zhǔn)確的質(zhì)量控制。本課題首先通過GC-MS確定了北柴胡藥材和注射液中的5種成分，通過對其中的2種成分，即正己醛和正庚醛成分的控制，建立了北柴胡藥材以及北柴胡注射液的成分含有量限值測定方法。

1 儀器和試藥

GCT型氣相色譜－高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司);NIST05標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫;GC8100氣相色譜儀，配有氫火焰檢測器(FID)(山東經(jīng)緯分析儀器有限公司)，Unmicro色譜工作站(上海微通分析技術(shù)有限公司)，KDM型調(diào)溫電熱套(佳祥電器)，揮發(fā)油提取器(沈陽禹王化玻儀器有限公司)。

北柴胡(參照《中國藥典》，對其進(jìn)行薄層色譜鑒定［12］，與對照品一致)10批(安徽海鑫中藥飲片有限公司，產(chǎn)地為蒙古，批號為 090101、090102、 090103、 090104、 090105、 090106、090107、090108、090109、090110)，北柴胡注射液10批(山東華信制藥集團(tuán)股份有限公司，規(guī)格2mL/支，批號為090101、090102、090103、090104、 090105、 090106、 090107、 090108、090109、090110)，1-辛烯(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、正己醛、正庚醛(天津光復(fù)試劑公司)均為色譜純，正己烷、無水硫酸鈉為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 GC-MS條件及供試品溶液制備

2.1.1 GC-MS條件 DB-35MS(30 m×0.25 mm×0.25μm)毛細(xì)管柱;載氣為高純氦(純度≥99.999%);體積流量1 mL/min;分流比10∶1;進(jìn)樣口溫度230℃;升溫程序為初始溫度60℃，保持3 min，以15℃/min的升溫速率升溫至250℃，保持3 min;EI電子源70 Ev，氦氣恒流模式1 mL/min，分流比50∶1，TOF質(zhì)量分析器。

2.1.2 供試品溶液的制備 取北柴胡20 g，于500 mL蒸餾瓶中，加水100 mL，在揮發(fā)油提取器中加水5 mL，加熱，以10滴/min的體積流量回流2 h，冷卻，取上層提取液用己烷定容至100 mL，加入無水硫酸鈉適量除水，即得。

2.2 GC條件及溶液制備

2.2.1 GC條件 二甲基硅氧烷共聚物的毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25μm);FID檢測器，檢測器溫度為280℃;載氣為氮?dú)猓w積流量為1 mL/min，分流比為10∶1，進(jìn)樣口溫度為280℃。升溫程序:初始溫度40℃，保持5 min，以10℃/min的升溫速率升溫至120℃，保持2 min。理論板數(shù)按1-辛烯峰計算應(yīng)不低于50000。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)物溶液的制備 取1-辛烯，加己烷稀釋成2 mg/mL的溶液，即得。

2.2.3 對照品溶液的制備 取對照品正己醛、正庚醛，加己烷稀釋成各含2 mg/mL的混合溶液，即得。

2.2.4 供試品溶液的制備 分別精密稱定北柴胡20 g和精密量取北柴胡注射液40 mL，于500 mL蒸餾瓶中，加水100 mL，在揮發(fā)油提取器中加水5 mL和內(nèi)標(biāo)物溶液1 mL，加熱，以10滴/min的體積流量回流2 h，冷卻，取上層提取液適量，并用己烷定容至1 mL，加入無水硫酸鈉適量除水，即得北柴胡藥材和注射液供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗 取對照品正己醛、正庚醛及1-辛烯，加己烷稀釋成各含1.6 mg/mL(80%的對照品濃度)、2 mg/mL(100%對照品濃度)、2.4 mg/mL(120%的對照品濃度)，再加入適量1-辛烯，配成分別含1-辛烯2 mg/mL和3種不同質(zhì)量濃度對照品的混合溶液，分別進(jìn)樣2次，計算平均校正因子。其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于1.85%。

2.3.2 重復(fù)性試驗 取北柴胡按定量測定項供試品溶液的制備方法制備5份，各取1μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。計算正己醛、正庚醛相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，均不大于1.19%。結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性符合方法學(xué)要求。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取北柴胡揮發(fā)油供試品溶液1μL，分別于0、2、4、6、8 h注入氣相色譜儀，計算正己醛、正庚醛相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，均不大于1.61%。結(jié)果表明供試品溶液8 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.3.4 線性關(guān)系試驗 取正己醛、正庚醛對照品適量，精密稱定，加己烷制成分別含正己醛、正庚醛0.02、0.2、2、10、20 mg/mL 5個不同質(zhì)量濃度的1-辛烯(含2 mg/mL)混合溶液。以質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，相對峰面積為縱坐標(biāo)，分別對正己醛和正庚醛進(jìn)行線性回歸，得到正己醛線性回歸方程為 Y=0.3264 X+0.0519，r=0.9998。正庚醛線性回歸方程為 Y=0.4177X+0.0028，r=0.9996。結(jié)果表明:正己醛、正庚醛在0.02～20 mg/mL范圍內(nèi)與氣相色譜峰響應(yīng)值線性關(guān)系良好，適宜用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行測定計算。

2.3.5 加樣回收率 取已測定含有量的北柴胡藥材批號09010110 g，分別加入等量的正己醛、正庚醛對照品，然后按上述樣品制備方法制備6份。分別進(jìn)樣1μL，記錄色譜圖，按內(nèi)標(biāo)法計算。6份樣品回收率相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于1.60%。結(jié)果如表1所示。

3 結(jié)果

3.1 GC-MS分析結(jié)果 把北柴胡揮發(fā)油的供試品溶液用氣-質(zhì)聯(lián)用儀，得到總離子流圖，結(jié)果見圖1，并結(jié)合NIST05標(biāo)準(zhǔn)庫，與標(biāo)準(zhǔn)圖譜核對，做定性分析，結(jié)果如表2所示。

根據(jù)GC-MS分析結(jié)果，我們確定了北柴胡揮發(fā)油中的5種化學(xué)成分，并最終確定了正己醛和正庚醛為共有組分，并進(jìn)行定量分析。根據(jù)10批氣相指紋圖譜的疊加圖，得到北柴胡藥材及其注射液的對照圖譜，如圖2、圖3所示。

表1 正己醛和正庚醛回收率試驗Tab.1 Results of recovery tests for hexyl aldehyde and heptaldehyde

圖1 北柴胡供試品溶液的GC-MS色譜圖Fig.1 GC-MS chromatogram of Bupleuri Radix

表2 北柴胡揮發(fā)油的GC-MS分析結(jié)果Tab.2 GC-MS analysisresultofvolatileoilfrom Bupleuri Radix

3.2 北柴胡藥材及其注射液含有量限值的確定

3.2.1 北柴胡藥材成分含有量限值的確定 取北柴胡10批，按上述方法檢測，結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，10批北柴胡按干品計含正己醛在0.030～0.047 mg/g之間;含正庚醛在 0.026～0.065 mg/g之間。所以取下限為含有量限值，即“按干品計，含正己醛每1 g不少于0.03 mg;含正庚醛每1 g不少于0.026 mg”。

圖3 北柴胡注射液成分對照指紋圖譜Fig.3 Standard fingerprint spectrum(FPS)of Bupleuri Radix Injection

表3 10批北柴胡藥材的測定結(jié)果Tab.3 Determination results of 10 batches of Bupleuri Radix

3.2.2 北柴胡注射液成分含有量限值的確定 取北柴胡注射液檢測，測定結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，10批柴胡注射液含正己醛在0.0071～0.0092 mg/mL之間;含正庚醛在 0.0054～0.0077 mg/mL之間。所以取下限為含有量限值，即每1 mL含正己醛不少于 7.1μg，含正庚醛不少于5.4μg。

4 討論

4.1 共有成分的確定 通過GC-MS成分分析結(jié)果可以看出，由于正己醛和正庚醛的相對保留時間比較固定，后三種物質(zhì)的相對位置不固定，不易辨認(rèn)，且峰面積較小，定量上存在困難，因此，最終確定正己醛和正庚醛進(jìn)行含有量限度測定。

表4 10批北柴胡注射液的測定結(jié)果Tab.4 Determination results of 10 batches of Bupleuri Radix Injection

4.2 揮發(fā)油提取時間的確定 取同一批北柴胡藥材(090101)，分別按提取時間為0.5、1、2、3、4 h制備揮發(fā)油供試品溶液，按測定項計算，結(jié)果如表5所示。結(jié)果表明，2 h為最佳提取時間。

表5 正庚醛、正己醛提取時間考察結(jié)果Tab.5 Extraction time of the determination of hexyl aldehyde and heptaldehyde

圖4 10批北柴胡藥材指紋圖譜疊加圖和對照圖譜RFig.4 GC-FPS of 10 batches of Bupleuri Radix and reference fingerprint R

4.3 柴胡揮發(fā)油氣相指紋圖譜 指紋圖譜［13］系指中藥材或其制劑經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)示該藥材或其制劑特性的共有峰的圖譜，以便識別真?zhèn)?、辨認(rèn)優(yōu)劣，確定其質(zhì)量和有效性。指紋圖譜相似度的評價方法主要有峰重疊率(Nei系數(shù)法)、相關(guān)系數(shù)法、距離系數(shù)法、向量夾角余弦法、和峰重疊率與共有峰強(qiáng)度結(jié)合法等方法［14-15］。本實驗采用的國家藥典委員會的“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”軟件對10批北柴胡藥材進(jìn)行相似度評價［16］，其原理是向量夾角余弦法，結(jié)果如圖4所示，表明，10批北柴胡藥材指紋圖譜的相似度良好，為后續(xù)實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性提供保證。

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