翟月

四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041

B細(xì)胞非霍奇金氏淋巴瘤是一種發(fā)病率較高，但目前治療效果不理想的腫瘤疾病[1]。紫草素作為紫草有效成分之一，在抗炎、抗微生物及抗腫瘤等作用受到人們關(guān)注。其中，紫草素作為抗腫瘤藥物，效能高，腫瘤耐藥性低[2]。Rajasekar S等人報(bào)道紫草素具有抗皮膚癌作用[3]。同時(shí)，紫草素可以抑制人類結(jié)直腸癌細(xì)胞在體內(nèi)外的生長(zhǎng)[4]。另外，紫草素可以通過(guò)活性氧物質(zhì)（reactive oxygen species，ROS）誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[5]。除了可以直接引起腫瘤細(xì)胞免疫原性的死亡，紫草素也能夠增強(qiáng)基于樹(shù)突細(xì)胞腫瘤疫苗的作用[6]，或是通過(guò)誘導(dǎo)活化正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的調(diào)節(jié)因子（Regulated on Activation,Normal T cell Expressed and Secreted,RANTES），增強(qiáng)基于基因表達(dá)的腫瘤疫苗[7]。然而，紫草素在B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的治療作用并不明確。本實(shí)驗(yàn)以人Raji細(xì)胞，即B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞作為對(duì)象，研究紫草素誘導(dǎo)Raji細(xì)胞死亡能力，進(jìn)一步了解紫草素對(duì)B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的抑制作用。

1.方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人Burkitt’s 淋巴瘤 Raji細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American type culture collection,ATCC）。Raji細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)，每2d換一次液。

1.2 PI染色檢測(cè)細(xì)胞死亡

105個(gè)/mL細(xì)胞1mL接種于12孔板，分別做對(duì)照組（CTL），紫草素組(SHK)，。對(duì)照組加入1.0μLDMSO，SHK組加入10μmolL-1紫草素，孵育6h。處理完成的細(xì)胞1 000 r/min離心5 min，棄去上清。用4 ℃ 預(yù)冷的PBS洗3 次，1 000 r/min 離心5min，去上清，用100 μL結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，加入5μL 的碘化丙啶(PI)溶液;混勻后于室溫避光孵育15 min;在反應(yīng)管中加入400 μL PBS，流式細(xì)胞儀分析。

1.3 中性紅檢測(cè)細(xì)胞存活率

中性紅可以被活細(xì)胞攝入后累積在溶酶體中，活細(xì)胞增多時(shí)攝入的中性紅量增加，而細(xì)胞活性下降或細(xì)胞數(shù)減少時(shí)攝入的中性紅會(huì)減少。因此，通過(guò)將5*105個(gè)/mL細(xì)胞1mL接種于12孔板，分別加入不同濃度的紫草素（0μmol·L-1，1.25μmol·L-1，2.5μmol·L-1，5μmol·L-1，10μmol·L-1，20μmol·L-1，40μmol·L-1及80μmol·L-1），孵育6h。紫草素誘導(dǎo)后，先用無(wú)菌PBS適當(dāng)溶液洗滌2次，隨后600μl細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，每孔加入60μl中性紅染色液,細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2小時(shí)。2小時(shí)后去除含有中性紅染色液的細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌1-2次。加入200微升中性紅檢測(cè)裂解液，室溫?fù)u床上裂解10分鐘。全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定樣品的A540，690nm作為參考波長(zhǎng)[8]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，借助GraphPad Prism5軟件進(jìn)行作圖。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以 ±SD表示.其中統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)以不同實(shí)驗(yàn)組與最對(duì)照組分別比較，采用t檢驗(yàn)。p<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.結(jié)果分析

2.1 紫草素誘導(dǎo)Raji細(xì)胞死亡

PI單染熒光顯微鏡分析結(jié)果如圖1所示，右圖加入紫草素的實(shí)驗(yàn)組中PI單陽(yáng)細(xì)胞，即死亡細(xì)胞數(shù)目明顯多于左圖實(shí)驗(yàn)組。由此可得出紫草素能夠誘導(dǎo)Raji細(xì)胞發(fā)生死亡。

圖1：紫草素對(duì)Raji細(xì)胞死亡的影響熒光顯微鏡下Raji細(xì)胞死亡情況，左圖為對(duì)照組，右圖為實(shí)驗(yàn)組。

2.2 紫草素誘導(dǎo)Raji細(xì)胞死亡呈濃度依賴

紫草素對(duì)Raji細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用如圖3所示。中性紅細(xì)胞存活率檢測(cè)（圖2）可知，隨著藥物濃度增大（0μmol·L-1，1.25μmol·L-1，2.5μmol·L-1，5μmol·L-1，10μmol·L-1，20μmol·L-1，40μmol·L-1及80μmol·L-1），紫草素對(duì)Raji細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用逐漸增強(qiáng)。以上實(shí)驗(yàn)證明紫草素可誘導(dǎo)Raji細(xì)胞死亡，并呈濃度依賴。

圖2 不同濃度紫草素對(duì)Raji細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

中性紅染色檢測(cè)不同濃度紫草素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。*表示p<0.05，**表示p<0.01。

3.討論

紫草素作為一種植物提取物，具有多種生物學(xué)功能，尤其是其腫瘤抑制作用受到廣泛認(rèn)可。紫草素抗腫瘤作用與其誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的能力有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)表明，紫草素可以抑制Raji細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，誘導(dǎo)Raji細(xì)胞死亡，并呈濃度依賴。這提示紫草素在非霍奇金B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤的治療中有重要作用。但紫草素治療腫瘤的機(jī)制，尤其是其誘導(dǎo)死亡的類型還有待進(jìn)一步研究。盡管紫草素對(duì)于許多疾病來(lái)說(shuō)是一種治療作用顯著的藥物，但其毒性不可忽視，合理規(guī)范的使用紫草素十分重要。

[1]Molyneux EM,Rochford R,Griffin B,et al.Burkitt's lymphoma[J].Lancet.2012 Mar 31;379(9822):1234-44.

[2]Wu H,Xie J,Pan Q,et al.Anticancer agent shikonin is an incompetent inducer of cancer drug resistance[J].PLoS One.2013;8(1):e52706.

[3]Rajasekar S,Park da J,Park C,et al.In vitro and in vivo anticancer effects of Lithospermum erythrorhizon extract on B16F10 murine melanoma[J].J Ethnopharmacol.2012 Nov 21;144(2):335-45.

[4]Fan Y,Jin S,He J,et al.Effect of β,β-Dimethylacrylshikonin on Inhibition of Human Colorectal Cancer Cell Growth in Vitro and in Vivo[J].Int J Mol Sci.2012;13(7):9184-93.

[5]Gong K,Li W.Shikonin,a Chinese plant-derived naphthoquinone,induces apoptosis in hepatocellular carcinoma cells through reactive oxygen species:A potential new treatment for hepatocellular carcinoma[J].Free Radic Biol Med.2011 Dec 15;51(12):2259-71.

[6]Chen HM,Wang PH,et al.Shikonin induces immunogenic cell death in tumor cells and enhances dendritic cell-based cancer vaccine[J].Cancer Immunol Immunother.2012 Nov;61(11):1989-2002.

[7]Chen HM,Wang PH,Aravindaram K,et al.Shikonin enhances efficacy of a gene-based cancer vaccine via induction of RANTES[J].J Biomed Sci.2012 Apr 12;19:42.

[8]Yu J,Xie J,Mao XJ,Wang MJ,et al.Hepatoxicity of major constituents and extractions of Radix Polygoni Multiflori and Radix PolygoniMultiflori Praeparata[J].J Ethnopharmacol.2011 Oct 11;137(3):1291-9.