★ 劉靖巖 賈艾玲 邱智東 (長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 長(zhǎng)春 130117)

通草提取工藝及其鑒別的研究

★ 劉靖巖*賈艾玲**邱智東 (長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 長(zhǎng)春 130117)

目的：對(duì)通草提取工藝及薄層鑒別進(jìn)行研究。方法：采用L9(34)正交設(shè)計(jì)安排實(shí)驗(yàn),用薄層色譜(TLC)進(jìn)行定性鑒別,用紫外分光光度法(UV)進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果：優(yōu)選了通草的最佳提取工藝，在薄層色譜中可檢出特征斑點(diǎn)。結(jié)論：該提取工藝和質(zhì)量控制方法科學(xué)合理,可作為通草生產(chǎn)和質(zhì)量控制的依據(jù)。

通草；提取工藝；薄層鑒別

通草為五加科植物通脫木Tetrapanaxpapyrifer(Hook)K.Koch的干燥莖髓。主要分布在西南及陜西、江蘇、安徽、浙江、江西、福建、臺(tái)灣、湖北、湖南、廣東、廣西等地，主產(chǎn)于臺(tái)灣、貴州、廣兩、云南。具有清熱利尿、通氣下乳等功效，用于濕溫尿赤、淋病澀痛、水腫尿少、乳汁不下。2010版《中國(guó)藥典》中對(duì)通草僅有性狀和顯微鑒別,缺少對(duì)其有效成分的鑒別和含量要求,而目前市售通草品種混亂,摻次摻偽日益增多。鑒于通草中多糖含量較高,本實(shí)驗(yàn)對(duì)此作出相關(guān)研究,對(duì)通草中多糖進(jìn)行含量測(cè)定并對(duì)其薄層進(jìn)行定性鑒別,為完善其質(zhì)量評(píng)價(jià)體系奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

紫外分光光度計(jì)(儀器型號(hào):TU-1810PC)，葡萄糖對(duì)照品(由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：110833—200904)，5%苯酚，硫酸溶液，購(gòu)自北京化工廠，所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,以總多糖含量和出膏率為考察指標(biāo),以加水量、煎煮次數(shù)、提取時(shí)間作為3個(gè)考察因素,優(yōu)化提取工藝，因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平表

2.2 總多糖含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

取葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱定，加蒸餾水制成每1mL含0.1mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

取水煎干膏適量，研細(xì)，過(guò)60目篩，精密稱定約0.2g，置于100mL錐形瓶中，加入蒸餾水50mL，密塞，稱定重量，超聲處理15分鐘，放冷，再稱定重量，用蒸餾水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，收集續(xù)濾液。吸取1mL續(xù)濾液置于10mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，再用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取對(duì)照品溶液(99.8μg/mL)0.1，0.2,0.4,0.6，0.8,1.0mL,分別置于10mL具塞試管中，加蒸餾水至1.0mL，加入1mL5%苯酚溶液，搖勻后，迅速加入5mL濃硫酸溶液，混勻，于100℃沸水浴中，加熱15分鐘后取出，放入冰浴中，冷卻15分鐘。在490nm處測(cè)定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)求得回歸方程：Y=0.00613X-0.05364，r=0.9999，結(jié)果表明，葡萄糖在9.98μg/mL～99.8μg/mL濃度范圍內(nèi)，與吸收度呈良好線性關(guān)系。

2.2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液0.6mL，置于10mL具塞刻度試管中，加入蒸餾水至1mL，按“2.2.3”項(xiàng)下的方法顯色，測(cè)定吸光度，重復(fù)6次。結(jié)果表明該方法的精密度良好,RSD為0.55%(n=6)。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液,按“2.2.3”項(xiàng)下的方法顯色,分別于0,10,20,30,40,50分鐘不同時(shí)間測(cè)定其吸光度,供試品RSD為0.15%，說(shuō)明供試品在50分鐘內(nèi)穩(wěn)定性較好，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

2.2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密稱取正交樣品中2號(hào)樣6份，每份0.2g按照供試品溶液項(xiàng)下的方法制備，精密吸取0.5mL供試品溶液置于具塞試管中，加蒸餾水至2.0mL。按“2.2.3”項(xiàng)下的方法顯色,測(cè)定吸光度，并計(jì)算總多糖平均含量為850.0764mg/g，RSD=2.52%，說(shuō)明重現(xiàn)性較好。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量供試品粉末(總多糖850.0764mg/g)6份,每份約0.1g,分別加入等量的葡萄糖對(duì)照品粉末,按“2.2.3”項(xiàng)下的方法顯色,測(cè)量吸光度值,并計(jì)算含量及加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，平均回收率為100.47%，RSD=2.12%。本法回收率較好，方法可行。

2.3 通草的提取制備最佳工藝確定：正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果表

由以上極差分析及方差分析可知，影響因素大小順序?yàn)椋篊gt;Agt;B，即煎煮次數(shù)C是主要影響因素，加水量A是次要影響因素，而煎煮時(shí)間B對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較小。各因素的最佳水平依次為：A因素的第1水平，B因素的第1水平，C因素的第3水平，確定A1B1C3為最佳提取方案，即加30倍量水，提取3次，每次1小時(shí)。

2.4 通草的定性鑒別

取本品粉末3g,加60%甲醇30mL,于水浴上加熱回流1小時(shí),濾過(guò),濾液蒸干,殘?jiān)蛹状?0mL溶解,濾過(guò),濾液濃縮至約1mL,作為供試品溶液。另取通草對(duì)照藥材3g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯(7∶3)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；噴以香草醛硫酸試液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

3 討論

3.1 以出膏率、總多糖轉(zhuǎn)移率為考察指標(biāo),通過(guò)綜合評(píng)分,由表4中極值F值大小顯示,各個(gè)因素作用主次為C﹥A﹥B,由表3方差分析結(jié)果表明,A因素?zé)o顯著性意義(P﹥0.05),B因素也無(wú)顯著性意義(P﹥0.05),C因素有顯著性意義(P﹤0.05),以A1B1C3為最佳,即以加30倍量水、煎煮提取3次、每次1小時(shí)為最佳提取工藝。

3.2 本實(shí)驗(yàn)在目前國(guó)內(nèi)對(duì)通草藥材化學(xué)成分研究較少的背景下采用TLC對(duì)其有效成分進(jìn)行鑒別,方法簡(jiǎn)便、易行,結(jié)果清晰,對(duì)儀器設(shè)備要求較低。由于《中國(guó)藥典》2010版一部通草項(xiàng)下并未收錄通草的薄層鑒別方法,通過(guò)條件摸索,初步定為展開(kāi)劑∶石油醚—乙酸乙酯(8∶2)，展開(kāi)時(shí)，對(duì)照藥材與供試品斑點(diǎn)Rf值均較低,把比例調(diào)整為石油醚—乙酸乙酯(7∶3)時(shí),則效果較好,斑點(diǎn)清晰;重現(xiàn)性好。

3.3 本實(shí)驗(yàn)對(duì)通草提取制備工藝進(jìn)行了研究,以主要有效成為指標(biāo),設(shè)計(jì)優(yōu)選了通草有效成分的最佳制備工藝;運(yùn)用UV、TLC等方法對(duì)通草進(jìn)行了化學(xué)表征和鑒別研究,初步建立了通草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),可作為通草生產(chǎn)和質(zhì)量控制的依據(jù)。今后還將對(duì)通草進(jìn)行多指標(biāo)檢測(cè),盡量闡明通草中的各種有效成分，進(jìn)一步完善通草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

劉靖巖，碩士研究生，中藥制劑研究方向，Tel：15164310437，E-mail：438831128@qq.com

**通訊作者:賈艾玲,碩士,助教,從事中藥制劑的研究,Tel:18684341320，E-mail:171265932@qq.com

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2013-07-22)