宋春麗 董巍 趙剛 劉紅彬 王麗婭 吉麗

伊布利特是一種新型的Ⅲ類抗心律藥物，其對房顫、房撲的轉(zhuǎn)復(fù)治療有明顯效果，但對室性心律失常的研究筆者所見報道不多。本文采取酶解法分離兔單個M細胞，應(yīng)用膜片鉗技術(shù)，通過離子通道角度觀察不同濃度的伊布利特對M細胞瞬間外向鉀電流(transient outside potassium current，Ito)活性的影響，為伊布利特用于臨床室性心律失常治療提供一定的基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 健康新西蘭純種白兔60只，雌雄兼用，重量2．3～2．5 kg。由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。飼養(yǎng)溫度18～29℃，相對濕度40% ～70%，顆粒飼料喂養(yǎng)。

1．2 液體配制 (1)Tyrode液、酶液、細胞保存液、Ito電極內(nèi)液、Ito細胞外液的配置參照文獻［1］;(2)伊布利特液:伊布利特10 mg，三水醋酸鈉18．9 mg，氯化鈉890 mg，用鹽酸調(diào)整pH值約4．6和注射用水適量加至100 ml，溶液配制完畢后充以100%的氧氣5 min以上;(3)富馬酸伊布利特由石藥集團中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司提供。實驗時在含有Ito的灌流液中加入伊布利特，使其最終的濃度達10－5mol/L、10－6mol/L。

1．3 單細胞分離［2］報道的方法分離出單個的心室肌細胞。整個過程保持恒溫36℃同時充入氧氣。

1．4 膜片鉗全細胞記錄［2］選擇條理清晰、表面光滑的單個心室肌細胞在25℃室溫下分別用正常的Ito外液和加入伊布利特 10－5mol/L、10－6mol/L 的 Ito 外 液 灌 流，灌 流 時 間5～10 min，速度為2 ml/min，使之達到規(guī)定的濃度，細胞破膜后穩(wěn)定5 min后分別記錄3組細胞液灌流后電流。

1．5 Ito記錄方法 先將細胞鉗制在－40 mV，50 ms后依次階躍10 mV去極化至 +110 mV，時程250 ms，刺激頻率0．5 Hz。以電壓為橫坐標，電流密度為縱坐標得到電流-電壓曲線(I-V曲線)，比較3組I-V曲線及+60 mV的Ito峰值電流密度變化。采用雙脈沖刺激法，先將細胞鉗制在 －50 mV，超極化至－160 mV，持續(xù)250 ms，階躍10 mV，去極化至 +70 mV，以電壓值為橫坐標，以Ito電流濃度為縱坐標，得到Ito的失活曲線。觀察3組的Ito電壓依賴性穩(wěn)態(tài)失活曲線及V0．5(半數(shù)失活電壓)的變化。當HP=－40 mV，去極化到+60 mV，測試脈沖與條件脈沖的間隔開始為30 ms，增量為15 ms逐級遞增至165 ms。以測試脈沖與條件脈沖的Ito之比為橫坐標，與恢復(fù)時間間隔為橫坐標作圖，得失活后再恢復(fù)曲線。觀察3組的Ito失活后再恢復(fù)過程的變化。

1．6統(tǒng)計學分析應(yīng)用SPSS 11．0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 伊布利特對I-V曲線的影響 3組呈電壓及濃度依賴性線形激活過程，10－5mol/L組，10-6 mol/L組I-V曲線均下移，對照組細胞在 －30 mV激活，伊布利特10-6 mol/L組在+10 mV激活，伊布利特10－5mol/L組在+20 mV激活。測試電壓+60 mV時電流密度顯示:對照組(n=14 cells)為(17．4±5．2)pA/pF，10－6mol/L 組(n=14 cells)為(6．0 ±1．2)pA/pF，與對照組相比下降明顯(P ＜0．01)。10－5mol/L組(n=14 cells)為(4．5±1．1)pA/pF，與對照組比較有明顯下降(P ＜0．01)。10－5mol/L組與10－6mol/L組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．01)。用藥前及低、高劑量伊布利特灌流后Ito形態(tài)曲線見圖1。3種狀態(tài)下Ito的I-V曲線見圖2。

2．2 伊布利特對穩(wěn)態(tài)失活曲線的影響 10－5mol/L組、10－6mol/L組失活曲線顯著左移，以10－5mol/L組明顯。3組的半數(shù)最大失活電壓，對照組(n=12 cells)為－(72．0±3．4)mV，10－6mol/L組(n=14 cells)為 － (109．4 ±4．6)mV，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0．01)，10－5mol/L組(n=14 cells)為 －(127．1 ±2．8)mV，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0．01)，10－5mol/L 組和 10－6mol/L 組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0．01)。見圖3。

圖1 3組細胞的鉀電流原始圖

圖2 3組細胞的鉀電流I-V曲線圖

圖3 3組細胞的鉀電流穩(wěn)態(tài)失活曲線圖

2．3 伊布利特對失活后再恢復(fù)曲線的影響 當2個脈沖間隔時間為45 ms時，對照組(n=12 cells)恢復(fù)42%，10－6mol/L組(n=15 cells)恢復(fù)31%，10－5mol/L組(n=15 cells)恢復(fù)25%，10－6mol/L，10－5mol/L組失活后再恢復(fù)與對照組相比，明顯減慢(P＜0．01)。當2個脈沖間隔時間為90 ms時，對照組(n=12 cells)恢復(fù)82%，10－6mol/L組(n=15 cells)恢復(fù)66%，10－5mol/L 組(n=15 cells)恢復(fù) 55%，10－6mol/L 和10－5mol/L組失活后再恢復(fù)與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0．01)。見圖 4。比較 3 組細胞在 45、90、120、165 ms失活后再恢復(fù)的程度，說明再恢復(fù)減慢。見圖5。3組Ito失活后再恢復(fù)的原始電流圖，顯示伊布利特10－5mol/L和10－6mol/L組使Ito電流減小，再恢復(fù)減慢，其中10－5mol/L減慢最為明顯。見圖6。

圖4 3組細胞的鉀電流失活后再恢復(fù)曲線圖

圖5 3組細胞的失活后再恢復(fù)的程度比較

圖6 3組細胞的鉀電流失活后再恢復(fù)原始記錄圖

3 討論

伊布利特應(yīng)用于臨床房顫、房撲的藥物轉(zhuǎn)復(fù)已作為Ⅰ類A級適應(yīng)證寫入2006年ACC/AHA/ESC心房顫動治療指南。伊布利特對房性心律失常的治療有較好的療效。該藥對室性心律失常也有抑制作用。伊布利特延長心室肌的有效不應(yīng)期和QT間期，其增加心室跨壁復(fù)極離散度的作用呈劑量依賴性。伊布利特減慢心室率，有抑制室速、室顫的作用，并能降低室顫除顫的閾值［3］。但其抗室性心律失常的確切電生理機制尚不清楚。

有研究認為，國產(chǎn)伊布利特的臨床應(yīng)用將能影響我國心律失常藥物治療的現(xiàn)狀［4］。其主要電生理機制為抑制復(fù)極時K+外向電流(Ikr)，促進平臺期緩慢內(nèi)向Na+電流，抑制0相快鈉內(nèi)流，促進平臺期內(nèi)向Ca2+內(nèi)流，此電生理機制已得到專家共識［3］，但其對Ito的研究筆者尚未見相關(guān)報道。Ito電流在動作電位的早期出現(xiàn)，與動作電位的1相有關(guān)，并參與動作電位的2相平臺期早期，它的改變可對動作電位時限產(chǎn)生較大影響。Ito分2型:Ito1和Ito2，Ito1對4-氨基吡啶(4-aminopyridine)敏感，又稱4-aminopyridine敏感型的瞬時外向鉀電流;實驗細胞外液中加入CdCl2以阻斷細胞外鈣離子內(nèi)流和電極內(nèi)液中含EGTA螯合細胞內(nèi)鈣離子，從而達到阻斷Ito2而記錄Ito1。通常所指的Ito為Ito1，與心律失常的產(chǎn)生關(guān)系密切。本研究發(fā)現(xiàn):伊布利特用藥組Ito電流峰值不同程度的下降，激活電壓及峰值右移，I-V曲線均下移，失活曲線、半數(shù)失活電壓明顯左移，失活后再恢復(fù)減慢，這些變化引起心肌細胞1相復(fù)極延遲，并導(dǎo)致動作電位2相平臺期相對延長，從而延長心室肌有效不應(yīng)期、動作電位時程和QT間期，使傳導(dǎo)減慢，故對室性心律失常起抑制作用。伊布利特引起心肌細胞Ito的抑制呈濃度依賴性，高濃度組的伊布利特對Ito抑制作用明顯強于低濃度組。

Ito在左心室游離壁的分布呈現(xiàn)出跨壁梯度，從心內(nèi)膜到心外膜Ito密度逐漸增加，這被認為是心室壁心肌細胞電生理性質(zhì)空間變異性產(chǎn)生的重要原因。有學者認為Ito的這種分布梯度也可能是決定整個心臟復(fù)極和除極順序的電學基礎(chǔ)，是導(dǎo)致2相全或無復(fù)極、動作電位平臺期不一致改變和2相折返的最重要的離子流之一，2相折返的機制與Ito跨心肌壁復(fù)極不均一性有關(guān)，促進室速或室顫的發(fā)生［5］。伊布利特作用心室肌M細胞后顯示:伊布利特抑制Ito，從而使1相復(fù)極延遲，并導(dǎo)致動作電位2相平臺期相對延長。使復(fù)極趨向一致，消除心室復(fù)極離散度，有利于消除折返，抑制室性快速心律失常的發(fā)生。

M細胞最顯著的特征是其具有比心內(nèi)、外膜層肌細胞明顯長的動作電位時程(APD)，具有明顯的慢頻率依賴性和較優(yōu)勢的Ito［6］。是否延長QT間期是III類抗心律失常藥物發(fā)揮作用的表現(xiàn)。在緩慢心率或刺激條件下，伊布利特對M細胞Ito的抑制作用，使其QT間期過度延長并在此基礎(chǔ)上易產(chǎn)生后除極(EAD)，局部EAD引起觸發(fā)活動，易導(dǎo)致尖端扭轉(zhuǎn)性室速。尤其見于女性、高齡、低鉀血癥、低鎂血癥、心力衰竭與心肌肥厚患者［7－9］。發(fā)生尖端扭轉(zhuǎn)室速時應(yīng)立即行直流電復(fù)律。

綜上所述，伊布利特對心室肌細胞Ito的抑制作用可部分解釋其抗室性心律失常的離子機制。由于本研究樣本數(shù)較少，存在一定的局限性，有待進一步增加樣本例數(shù)深入研究。且僅對動物正常的心室肌細胞進行了實驗室觀察，對臨床應(yīng)用是否抑制室性心律失常的發(fā)生或轉(zhuǎn)復(fù)須進一步觀察。

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2 齊書英，張霞，劉曉云，等．缺血/再灌注對心肌瞬間外向鉀電流的影響．心臟雜志，2006，18:47-49．

3 中國生物醫(yī)學工程學會心律分會，中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會心電學技術(shù)分會．中國醫(yī)師協(xié)會心血管內(nèi)科醫(yī)師分會，伊布利特臨床應(yīng)用中國專家共識(2010)．中國心臟起搏與心電生理雜志，2011，25:1-11．

4 王建安．國產(chǎn)伊布利特將影響我國心律失常藥物的治療現(xiàn)狀．臨床心電學雜志，2008，17:1-3．

5 Antzelevitch C，Brugada P，Brugada J，et al．Brugada syndrome:a decade of progress．Circ Res，2002，91:1114-1118．

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8 Taira CA，Opezzo JA，Mayer MA，et al．Cardiovascular drugs inducing QT prolongation:facts and evidence．Curr Drug Saf，2010，5:65-72．

9 Farkas AS，Nattel S．Minimizing-repolarization related proarrhythmic risk in drug development and clinical practice．Drugs，2010，70:573-603．