陳偉平，楊瓊潔，衛(wèi) 星

(浙江大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310015)

機(jī)體衰老是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多器官、多系統(tǒng)功能的衰退。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，衰老與自由基對(duì)機(jī)體的損害有關(guān)，自由基可與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等發(fā)生反應(yīng)，破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，從而導(dǎo)致衰老。許多資料表明，人體衰老存在著學(xué)習(xí)記憶減退和認(rèn)知功能障礙。D-半乳糖致衰老模型是較有代表性的致衰老模型，其機(jī)理與半乳糖可在體內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基，從而誘發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷有關(guān)［1］。目前少數(shù)隨機(jī)臨床試驗(yàn)表明，給予輕度阿爾茨海默病(AD)或輕度認(rèn)知障礙患者ω-3 系不飽和脂肪酸后可以改善其癥狀;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明，長(zhǎng)期給予AD 模型動(dòng)物ω-3 系不飽和脂肪酸后可以降低動(dòng)物體內(nèi)ω-6 系/ω-3 系不飽和脂肪酸的比例，減少β-淀粉樣蛋白的含量，并改善其認(rèn)知功能［2］。蠶蛹油中含有大量的ω-3 系不飽和脂肪酸，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，但未見蠶蛹油對(duì)衰老過程中認(rèn)知能力影響的報(bào)道。本研究旨在觀察蠶蛹油對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及機(jī)體抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性ICR 小鼠，26～32 g，50只，購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠置于不銹鋼籠內(nèi)，10 只一籠。在恒溫22～25℃，相對(duì)濕度45%～60%，光照正常的環(huán)境中進(jìn)行5天適應(yīng)性喂養(yǎng)后，分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 材料及試劑 蠶蛹購(gòu)自浙江第一絲廠，挑選新鮮蠶蛹，并置于烘箱60℃以下烘干，粉碎機(jī)粉碎成細(xì)粉，按本實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法制備蠶蛹油，制成品中不飽和脂肪酸達(dá)93%以上，其中α-亞 麻 酸54.6%，亞 油 酸10.7%，油 酸27.2%，棕櫚油酸1.0%。D-半乳糖(購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司);吡拉西坦(腦復(fù)康，購(gòu)自杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào):20110310);無(wú)水乙醇(杭州長(zhǎng)青化工);0.86%生理鹽水(自制)?？捡R斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào):20110330);超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào):20110330);丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào):20110330);谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào):20110330)。

1.3 Morris 水迷宮 華北正華產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組 將50 只健康雄性小鼠隨機(jī)分為5組，每組10 只。分別為①空白組:上午注射生理鹽水15 ml/kg·d，下午灌胃生理鹽水10 ml/kg·d，連續(xù)30 d(下同)。②模型組:上午腹腔注射20%的D-半乳糖3000 mg/kg·d，下午灌胃生理鹽水10 ml/kg·d。③蠶蛹油6 ml/kg·d組:上午注射20%的D-半乳糖3000 mg/kg·d，下午灌胃蠶蛹油6 ml/kg·d。④蠶蛹油12 ml/kg·d組:上午注射20%的D-半乳糖3000 mg/kg·d，下午灌胃蠶蛹油12 ml/kg·d。⑤腦復(fù)康對(duì)照組:上午注射20%的D-半乳糖3000 mg/kg·d，下午灌胃腦復(fù)康10 ml/kg·d。第31天進(jìn)行定位航行試驗(yàn)和空間搜索試驗(yàn);第37天脫臼處死動(dòng)物，取全腦，稱重，進(jìn)行勻漿，勻漿液再經(jīng)10000 r/min 低溫離心，取上清液測(cè)定組織蛋白含量、SOD 活力、MDA 含量及GSH-PX 活性。蛋白質(zhì)測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法，其它的測(cè)定按說明書進(jìn)行。

1.4.2 定位航行試驗(yàn) 用于測(cè)量動(dòng)物在水迷宮中的學(xué)習(xí)和記憶能力。實(shí)驗(yàn)歷時(shí)4天。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物自由游泳2 min。正式實(shí)驗(yàn)每天訓(xùn)練4次，每次60 s，隨機(jī)從東、西、南、北四個(gè)入水點(diǎn)選擇一個(gè)，將動(dòng)物面向池壁放入水中，記錄動(dòng)物尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間即逃避潛伏期(escape latency)。如果動(dòng)物在60 s 內(nèi)未找到平臺(tái)，由實(shí)驗(yàn)者將其引至平臺(tái)，逃避潛伏期記為60 s，動(dòng)物在平臺(tái)上停留20 s。每次訓(xùn)練之間和4次訓(xùn)練完成后，迅速將動(dòng)物洗凈擦干，置于加熱器旁，以防動(dòng)物低體溫。每只動(dòng)物共計(jì)訓(xùn)練16次。計(jì)算每天各組4次逃避潛伏期。

1.4.3 空間搜索試驗(yàn) 用于測(cè)量動(dòng)物對(duì)平臺(tái)空間位置準(zhǔn)確記憶，即記憶保持能力。試驗(yàn)動(dòng)物訓(xùn)練4天后，于第5天撤除平臺(tái)，任選一個(gè)入水點(diǎn)將動(dòng)物放入水中，動(dòng)物在水中游泳60 s，測(cè)量60 s 內(nèi)動(dòng)物穿過平臺(tái)所在位置的次數(shù)以及第1次穿越平臺(tái)所需時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以SPSS11.5 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，模型組與空白對(duì)照組的均值差異比較采用t-檢驗(yàn)，各治療組與模型組的均值比較采用Dunnett-t 檢驗(yàn)，采用兩個(gè)顯著性水平，分別為95%(P＜0.05)和99%(P＜0.01)。所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的一般情況 適應(yīng)性飼養(yǎng)5天時(shí)全部小鼠毛發(fā)有光澤且柔軟，精神飽滿且活潑好動(dòng)、食欲旺盛，尿液為透明淺黃色;造模期間，空白組小鼠依舊，然體重穩(wěn)步增加。模型組小鼠飲食正常，活動(dòng)減少，皮毛逐漸干枯稀疏，后期有皮毛凌亂的現(xiàn)象，體重也是呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。如表1 所示，各組體重在處死前和給藥前有明顯增長(zhǎng)，給藥前體重組間并無(wú)明顯差異，處死前組間也無(wú)顯著差異。

2.2 定位航行試驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)過4天的定位航行實(shí)驗(yàn)，5組動(dòng)物的逃避潛伏期均迅速下降，前3天并無(wú)顯著差異，到第4天時(shí)各組顯示差別。模型組的潛伏期與空白對(duì)照組比較明顯延長(zhǎng)，說明模型復(fù)制成功。蠶蛹油12 ml/kg·d組與6 ml/kg·d組與模型組比較也呈現(xiàn)差異顯著(P＜0.05)。見表2。

表1 各組小鼠的體重變化Table 1 Changes of body weight in each group()

表1 各組小鼠的體重變化Table 1 Changes of body weight in each group()

n 為每組小鼠數(shù)量，以下表格同.

表2 各組小鼠定位航行試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of space navigation test in each group()

與模型組比較，* :P＜0.05，＊＊:P＜0.01.

2.3 空間搜索試驗(yàn)結(jié)果 蠶蛹油6 ml/kg·d組逃避潛伏期明顯短于模型組(P＜0.05);蠶蛹油12 ml/kg·d組與6 ml/kg·d組穿越平臺(tái)次數(shù)明顯多于模型組(P＜0.05)。見表3。

表3 各組小鼠空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of spatial probe test in each group()

表3 各組小鼠空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of spatial probe test in each group()

與空白組比較，△:P＜0.05，△△:P＜0.01;與模型組比較，* :P＜0.05，＊＊:P＜0.01.

2.4 蠶蛹油對(duì)小鼠腦組織中SOD 活性的影響各組小鼠腦組織中SOD 活性測(cè)定結(jié)果表明，與空白組相比較，模型組小鼠腦組織SOD 活性明顯降低(P＜0.01)，表明D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠后，對(duì)小鼠腦組織造成了嚴(yán)重的損傷，說明造模成功。與模型組相比，各給藥組均表現(xiàn)出不同程度增加SOD 活性的效果，各組與模型組比較均呈現(xiàn)出明顯差異(P＜0.05)，說明蠶蛹油能有效清除超氧陰離子自由基(O2-·)，具保護(hù)細(xì)胞免受損傷的作用，其中12 ml/kg·d組效果更為顯著，其提高SOD 活性的效果與腦復(fù)康組基本相同，說明蠶蛹油有減輕腦組織氧化損傷的作用，并具有劑量依賴性，且總體防治效果佳于腦復(fù)康。見表4。

表4 蠶蛹油對(duì)D-半乳糖所致腦損傷小鼠的SOD 活性的影響()Table 4 Effects of chrysalis oil on activity of superoxide dismutase (SOD)in Dgalactose induced brain damage in mice

表4 蠶蛹油對(duì)D-半乳糖所致腦損傷小鼠的SOD 活性的影響()Table 4 Effects of chrysalis oil on activity of superoxide dismutase (SOD)in Dgalactose induced brain damage in mice

與空白組比較，△△:P＜0.01;與模型組比較，* :P＜0.05.

2.5 蠶蛹油對(duì)小鼠腦組織中MDA 水平的影響 從表4、5 以看出，與空白組相比，模型組小鼠腦組織MDA 含量顯著升高(P＜0.01)，證明了氧化應(yīng)激及過氧化作用參與了腦氧化損傷模型的形成。各給藥組都能有效降低腦組織MDA 的含量(P＜0.05)，且12 ml/kg·d組比6 ml/kg·d組的降幅更明顯，與空白組接近，說明蠶蛹油具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可減輕自由基對(duì)腦細(xì)胞的損傷。

表5 蠶蛹油對(duì)D-半乳糖所致腦損傷小鼠的MDA 水平的影響Table 5 Effects of chrysalis oil on level of malondialdehyde (MDA) in Dgalactose induced brain damage in mice()

表5 蠶蛹油對(duì)D-半乳糖所致腦損傷小鼠的MDA 水平的影響Table 5 Effects of chrysalis oil on level of malondialdehyde (MDA) in Dgalactose induced brain damage in mice()

與空白組比較，△△:P＜0.01;與模型組比較，* :P＜0.05，＊＊:P＜0.01.

2.6 蠶蛹油對(duì)小鼠腦組織中GSH-PX 活性的影響 結(jié)果表明，與空白組比較，模型組小鼠腦組織勻漿GSH-PX 活性顯著降低(P＜0.001)。與模型組比較，蠶蛹油12 ml/kg·d組和腦復(fù)康組能提高GSH-PX 活性(P＜0.05)，但蠶蛹油6 ml/kg·d組差別不顯著。蠶蛹油對(duì)D-半乳糖所致腦損傷小鼠的腦組織勻漿GSH-PX 活性的影響見表6。

表6 蠶蛹油對(duì)D-半乳糖所致腦損傷小鼠的GSH-PX 活性的影響Table 6 Effects of chrysalis oil on activity of glutathione peroxidase (GSH-PX)in D-galactose induced brain damage in mice()

表6 蠶蛹油對(duì)D-半乳糖所致腦損傷小鼠的GSH-PX 活性的影響Table 6 Effects of chrysalis oil on activity of glutathione peroxidase (GSH-PX)in D-galactose induced brain damage in mice()

與空白組比較，△△:P＜0.01;與模型組比較，* :P＜0.05.

3 討論

D-半乳糖衰老模型是由我國(guó)學(xué)者龔國(guó)清等1991 年首次提出［3］，其后許多學(xué)者在大鼠和小鼠身上證實(shí)該模型表現(xiàn)出與人類自然衰老類似的生化指標(biāo)變化。D-半乳糖進(jìn)入機(jī)體后被還原成半乳糖醇，半乳糖醇不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，使?jié)B透壓升高而導(dǎo)致細(xì)胞腫脹及代謝紊亂，造成細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致機(jī)體衰老。該模型造模周期短、重復(fù)性好、模型穩(wěn)定，是國(guó)際上公認(rèn)的衰老模型。張林波等的研究發(fā)現(xiàn)［1］，在用D-半乳糖造模過程中，小鼠血清和腦組織中SOD 活性下降，MDA 含量升高，認(rèn)為氧化應(yīng)激參與了衰老的發(fā)展過程，MDA 是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，其含量間接反映了細(xì)胞受自由基攻擊后的脂質(zhì)過氧化程度。GSHPX 是體內(nèi)十分重要的抗氧化酶，其功能是去除細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化物，GSH-PX 水平的高低反映機(jī)體的抗氧化能力的強(qiáng)弱。因此，我們也選用了小鼠腦組織中SOD、GSH-PX 活性和MDA含量作為評(píng)估蠶蛹油抗氧化作用的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦證實(shí)，注射D-半乳糖30天后可使小鼠腦組織中SOD、GSH-PX 活力下降，MDA 含量升高，脂質(zhì)過氧化作用增加，小鼠學(xué)習(xí)能力下降，記憶功能障礙明顯，這與機(jī)體衰老時(shí)的行為和生化指標(biāo)相符合。

通過水迷宮的定位航行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蠶蛹油6 ml/kg·d組小鼠尋找平臺(tái)的潛伏期在第4天開始較模型組有明顯減小，具有顯著差異。12 ml/kg·d組雖有減少的趨勢(shì)，但差別不顯著，這可能與我們實(shí)驗(yàn)的樣本數(shù)較少有關(guān)。空間搜索實(shí)驗(yàn)中，蠶蛹油6 ml/kg·d組小鼠的逃避潛伏期明顯小于模型組小鼠，具顯著差異;而60 s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)，蠶蛹油6 ml/kg·d組、12 ml/kg·d組均明顯多于模型組小鼠，具有顯著差異，說明蠶蛹油對(duì)D-半乳糖所致衰老模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力具有顯著的改善作用。生化指標(biāo)測(cè)定表明，蠶蛹油12 ml/kg·d組能顯著提高D-半乳糖所致衰老小鼠腦組織SOD、GSHPX 活性，抑制自由基的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA 的含量，減輕自由基對(duì)腦組織的損傷。這提示蠶蛹油改善D-半乳糖所致衰老模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力可能與蠶蛹油在機(jī)體中產(chǎn)生的抗氧化作用有關(guān)。

蠶蛹油中含有大量的α-亞麻酸，α-亞麻酸是ω-3 系不飽和脂肪酸的母體脂肪酸，在體內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)镋PA、DHA 等，其中DHA 是人腦和視網(wǎng)膜脂質(zhì)的主要組成部分，被稱為“腦黃金”，它的缺乏可導(dǎo)致學(xué)習(xí)能力低下，影響視力［4］。另外，蠶蛹油中ω-6 系/ω-3 系不飽和脂肪酸的比例約為1/5，如長(zhǎng)期給予蠶蛹油，必然會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)ω-6 系/ω-3 系不飽和脂肪酸比例的下降，從而起到改善其認(rèn)知功能的作用。目前，研究ω-3 系不飽和脂肪酸對(duì)嬰幼兒智力發(fā)育的影響和對(duì)早老性癡呆癥的預(yù)防及治療作用，已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)之一［5］。

［1］ZHANG Linbo，HUANg Shuai，MA Guangli，et al(張林波，黃帥，馬廣利，等).Effect of Oxidative Stress in D-galactose Induced Mouse Aging model［J］.Chinese Journal of Gerontology(中國(guó)老年學(xué)雜志)，2010，30(11):1527-1529.(in Chinese)

［2］CARLIJN R.HOOIJMANS，PIETERNEL C M.Pasker-de Jong，Rob B.M.de Vries，et al.The Effects of Long-Term Omega-3 Fatty Acid Supplementation on Cognition and Alzheimer' s Pathology in Animal Models of Alzheimer' s Disease:A Systematic Review and Meta-Analysis［J］.Journal of Alzheimer's Disease，2012，28:191-209.

［3］GONG Guoqing，XU Fuben(龔國(guó)清，徐黻本).Study of Aging Model in Mice ［J］.Journal of China Pharmaceutical University(中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào))，1991，22(2):101-103.(in Chinese)

［4］QIU Pengcheng，WANG Siwang，WANG Jianbo，et al(邱鵬程，王四旺，王劍波，等).Effect ofα-Linolenic Acid Resource and Application Prospect［J］.Lishzhen Medicine and Materia Medica Reserch(時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥)，2010，21(3):760-762.(in Chinese)

［5］REN H，GNEBREMESKEL K，OKPALA I，et al.Patients with Sickle Cell Disease Have Reduced Blood Antioxidant Protection ［J］.Int J Vitam Nutr Res，2008，78(3):139-147.