范 猛，姜文學(xué)，汪愛媛，彭 江，張 莉，許文靜，盧世璧

1天津市第一中心醫(yī)院骨科，天津300192

2中國人民解放軍總醫(yī)院骨科研究所，北京100853

股骨頭缺血性壞死多見于30～40歲的青壯年，發(fā)病率逐年升高，其中多數(shù)患者都將進(jìn)展為股骨頭塌陷，需要進(jìn)行人工關(guān)節(jié)置換手術(shù)［1］。人工關(guān)節(jié)置換手術(shù)早期療效可靠，但遠(yuǎn)期仍有松動等情況，需要進(jìn)行翻修手術(shù)［2］。目前有多種的保頭治療，包括:電磁刺激、近端旋轉(zhuǎn)截骨、髓心減壓和骨移植等，均有一定療效，但多數(shù)患者的病情仍會進(jìn)展至股骨頭塌陷［3］。目前需要研究更有效的預(yù)防股骨頭壞死塌陷的治療方法。二磷酸鹽具有抑制破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨破壞的作用，在多個基礎(chǔ)及臨床研究中都證實其具有抑制破骨細(xì)胞的骨吸收以及減少股骨頭變形的作用。然而研究發(fā)現(xiàn)單獨應(yīng)用二磷酸鹽治療骨壞死，可以抑制骨流失而具有減少股骨頭變形的作用，但是同時新骨形成卻很少［4］，只是延緩了病情，最終仍會進(jìn)展到塌陷［5］。Vandermeer等［5］提出，理想的骨壞死修復(fù)過程是在減少壞死骨吸收的同時，促進(jìn)新骨的形成來提高骨量，保持股骨頭的力學(xué)強(qiáng)度。本研究觀察同時給予唑來膦酸和成骨因子NEL樣1型基因 (NEL-like type 1 gene，NELL-1)的方式預(yù)防股骨頭壞死塌陷的效果。

材料和方法

材料 雄性SD大鼠24只，體重 (392±24.2)g，由解放軍總醫(yī)院實驗動物中心提供，按照SPF級別標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行管理，自由飲食。NELL-1質(zhì)粒為美國加利福尼亞大學(xué)洛杉磯分校Kang Ting教授惠贈，以腺病毒作為載體，構(gòu)建NELL-1重組腺病毒載體，具體方法參考Xue等［6］報道方法。唑來膦酸由諾華藥品公司(Norvartis Pharma AG)提供。使用儀器為美國GE eX-plore Locus小動物活體顯微CT，最大分辨率27 μm，圖像后處理軟件為GE公司提供的GE Micro View。

動物模型的建立 將24只大鼠采用抽簽法分為3組:假手術(shù)組、安慰劑組和NELL-1唑來膦酸聯(lián)合治療組，每組8只。安慰劑組和NELL-1唑來膦酸聯(lián)合治療組共16只參考Peled等［7］報道的方式建立模型:給予10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射進(jìn)行麻醉，麻醉滿意后術(shù)區(qū)脫毛，清洗備皮后碘伏消毒，鋪無菌巾單，以大轉(zhuǎn)子處為中心，取右髖部外側(cè)切口，長約3 cm，分離皮下組織，鈍性沿肌纖維方向分離臀大肌，牽開肌肉，切開髖關(guān)節(jié)囊顯露股骨頭，將髖關(guān)節(jié)脫位，切斷圓韌帶，鈍性剝離股骨頸近端骨膜組織，將髖關(guān)節(jié)復(fù)位，保護(hù)坐骨神經(jīng)并保持髖關(guān)節(jié)深層肌肉完整以避免術(shù)后髖關(guān)節(jié)脫位。生理鹽水沖洗創(chuàng)面，分層關(guān)閉傷口。假手術(shù)組同另兩組方法進(jìn)行麻醉，在切開皮膚后鈍性分離臀大肌后，生理鹽水沖洗創(chuàng)面，分層關(guān)閉傷口。術(shù)后麻醉蘇醒后均正常飲食及活動。

術(shù)后處理 術(shù)后1周，將唑來膦酸溶于生理鹽水(1 mg溶于2 ml生理鹽水)，按照0.2 ml/kg劑量即0.1 mg/kg給予NELL-1唑來膦酸聯(lián)合治療組單次皮下注射唑來膦酸生理鹽水溶液，并給予0.2 ml含1×109噬斑形成單位的NELL-1重組腺病毒載體的生理鹽水單次髖關(guān)節(jié)局部注射。安慰劑組及假手術(shù)組給予生理鹽水0.4 ml/kg單次皮下注射。繼續(xù)正常飲食及活動。術(shù)后5周，給予過量苯巴比妥鈉肌肉注射處死。分別取出各組實驗動物右側(cè)股骨標(biāo)本，給予4%多聚甲醛固定2周。

X光照相圖像處理 行股骨標(biāo)本前后位X光照相檢查，曝光條件為32 kV，10 ms，放大比率×1。測量圖像，分別測量股骨頭的高度及寬度，并計算股骨頭的高度及寬度的比值。

顯微CT掃描 將股骨縱軸與顯微CT檢查床滑軌的移動軸平行近端進(jìn)行顯微CT掃描，掃描分辨率為27 μm，單次掃描時間86 min。對顯微CT掃描的結(jié)果用標(biāo)準(zhǔn)體模校準(zhǔn)后，手動選取股骨頭區(qū)域建立三維興趣區(qū)，興趣區(qū)為完整股骨頭區(qū)域。根據(jù)股骨頭內(nèi)骨質(zhì)閾值分布選取1600 HU作為閾值進(jìn)行計算，分別計算股骨頭總體積、骨組織體積、骨體積分?jǐn)?shù) (骨組織體積/股骨頭總體積)、骨礦密度、骨小梁厚度、骨小梁間隙寬度。

組織學(xué)檢查 EDTA脫鈣后股骨頭冠狀位切5 μm薄片，行組織學(xué)檢查。分別行常規(guī)HE染色、抗酒石酸性磷酸酶 (tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色，骨橋蛋白 (osteopontin，OPN)、血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)免疫組織化學(xué)染色。

統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間數(shù)據(jù)比較采用單因素ANOVA分析 (One-way ANOVA test)，采用LSD檢驗進(jìn)行各組的兩兩比較，采用卡方檢驗數(shù)據(jù)方差齊性。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

大體觀察 各組動物在實驗過程中均無死亡及傷口感染，患肢術(shù)后1周均可負(fù)重。處死取標(biāo)本時各組股骨頭均未見明顯脫位，關(guān)節(jié)面未見明顯骨性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)。NELL-1唑來膦酸聯(lián)合治療組見股骨頭形態(tài)良好，安慰劑組可見股骨頭輕度變扁。各組均未觀察到異位成骨現(xiàn)象。安慰劑組股骨頭冠狀位切面存在明顯骨吸收及股骨頭形態(tài)改變，NELL-1唑來膦酸聯(lián)合治療組改變不明顯 (圖1)。

X光照相表現(xiàn) 安慰劑組股骨頭明顯變形，存在明顯的骨吸收骨量減少。NELL-1唑來膦酸聯(lián)合治療組相對于假手術(shù)組僅存在輕度股骨頭變形，股骨頭整體形態(tài)保持良好 (圖2)。治療組股骨頭高度與寬度比值明顯高于安慰劑組 (P＜0.01)，而與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)(圖3)。

顯微CT表現(xiàn) 顯微CT圖像可見安慰劑組股骨頭變形明顯，股骨頭變小變扁;與假手術(shù)組相比，NELL-1唑來膦酸聯(lián)合治療組股骨頭形態(tài)輕度變小，但遠(yuǎn)好于安慰劑組 (圖4)。3組股骨頭總體積、骨組織體積、股骨頭骨礦鹽含量NELL-1唑來膦酸聯(lián)合治療組和假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)，但均大于安慰劑組 (P＜0.01)。3組骨礦密度、骨小梁厚度和骨小梁間隙差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)(圖5)。

組織學(xué)檢查

HE染色:假手術(shù)組股骨頭形態(tài)良好，骨小梁內(nèi)骨陷窩均有骨細(xì)胞填充，NELL-1唑來膦酸聯(lián)合治療組股骨頭形態(tài)良好，骨小梁排列整齊，股骨頭內(nèi)部分區(qū)域內(nèi)骨陷窩內(nèi)有骨細(xì)胞填充，部分區(qū)域內(nèi)表現(xiàn)為空骨陷窩。安慰劑組股骨頭高度變低，骨小梁較假手術(shù)組稀疏，且廣泛存在以空骨陷窩為標(biāo)志的壞死骨 (圖6)。

圖1 各組股骨頭冠狀剖面圖Fig 1 Coronal images of femoral head in each group

圖2 各組股骨標(biāo)本X光照相前后位片F(xiàn)ig 2 Antero-posterior X-ray images of proximal femur

圖3 股骨頭高度與長度比值Fig 3 Comparison of the height and length ratio of femoral head among all groups

圖4 各組標(biāo)本的顯微CT冠狀位斷層圖像Fig 4 Coronal slice micro-CT images of proximal femur

TRAP染色:破骨細(xì)胞定義為TRAP染色陽性的靠近骨表面的有3個核以上的細(xì)胞。假手術(shù)組未發(fā)現(xiàn)股骨頭內(nèi)有明顯的破骨細(xì)胞，股骨頭內(nèi)未發(fā)現(xiàn)死骨存在。安慰劑組股骨頭內(nèi)可見散在的破骨細(xì)胞。NELL-1唑來膦酸聯(lián)合治療組見股骨頭內(nèi)骨小梁較少量破骨細(xì)胞 (數(shù)量較安慰劑組少)(圖7)。

OPN免疫組織化學(xué)染色:成骨細(xì)胞定義為OPN染色陽性，分布在骨邊緣的方形的細(xì)胞。假手術(shù)組可見均為活骨，在軟骨細(xì)胞與骨細(xì)胞交界區(qū)域，可見較多成骨細(xì)胞存在。安慰劑組可見死骨與活骨散在分布，在死骨與活骨交界區(qū)域，可見少量成骨細(xì)胞存在。NELL-1唑來膦酸治療組活骨與死骨交替存在，在骨小梁邊緣可見大量OPN染色陽性排列整齊的方形細(xì)胞 (圖8)。

VEGF免疫組織化學(xué)染色:VEGF為血管內(nèi)皮生長因子染色，顯示血管新生情況。假手術(shù)組可見均為活骨，未見明顯VEGF陽性表現(xiàn)。安慰劑組在死骨與活骨交替區(qū)域，即修復(fù)界面存在較多的VEGF陽性表現(xiàn)，顯示存在較活躍的血管新生。NELL-1唑來膦酸聯(lián)合治療組顯示以死骨活骨交替存在，以活骨為主，可見骨髓腔內(nèi)較多的VEGF陽性表現(xiàn) (圖9)。

圖5 各組股骨頭總體積 (A)、股骨頭內(nèi)骨量 (B)、股骨頭內(nèi)骨量/股骨頭總體積 (C)、股骨頭骨礦鹽含量 (D)比較Fig 5 Comparison of total volume(A)，bone volume(B)，bone volume/total volume(C)，and tissue mineralized content(D)among all groups

圖6 股骨頭HE染色結(jié)果Fig 6 HE staining of femoral head

圖7 股骨頭標(biāo)本抗酒石酸性磷酸酶染色Fig 7 Tartrate-resistant acid phosphatase staining of femoral head

圖8 股骨頭標(biāo)本骨橋蛋白免疫組織化學(xué)染色Fig 8 Immunohistochemical staining of osteopontin in femoral head

討 論

在創(chuàng)傷性骨壞死的修復(fù)過程中，骨結(jié)構(gòu)的破壞造成了關(guān)節(jié)功能的障礙。本研究觀察到NELL-1聯(lián)合唑來膦酸具有抑制破骨細(xì)胞活動并促進(jìn)成骨細(xì)胞活動的作用，具有明顯的減輕股骨頭變形的作用。本研究將NELL-1用于骨壞死的保頭治療，并根據(jù)其作用機(jī)制和骨壞死病理過程聯(lián)合唑來膦酸使用，在較好保持股骨頭外形的情況下進(jìn)行骨壞死的修復(fù)，預(yù)防了股骨頭壞死的塌陷。比較3組間股骨頭的體積、股骨頭內(nèi)骨量、股骨頭骨礦鹽含量，NELL-1和唑來膦酸聯(lián)合治療組與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，明顯大于安慰劑組。

本模型通過手術(shù)破壞股骨頭及頸部的血運(yùn)，成功建立了創(chuàng)傷性骨壞死動物模型，安慰劑組可見股骨頭內(nèi)廣泛存在的空骨陷窩，且存在伴隨的修復(fù)反應(yīng)，存在死骨與活骨的修復(fù)界面，以及骨小梁結(jié)構(gòu)的明顯改變。通過顯微CT檢查發(fā)現(xiàn)股骨頭形態(tài)變扁，股骨頭體積減小，骨礦物量減小，存在明顯的骨吸收現(xiàn)象。TRAP染色、OPN和VEGF免疫組織化學(xué)染色顯示，存在破骨細(xì)胞活動、血管新生活躍以及成骨細(xì)胞活動，存在骨修復(fù)反應(yīng)。所以本模型是成功的股骨頭骨壞死創(chuàng)傷性動物模型。與假手術(shù)組比較，安慰劑組可見破骨細(xì)胞明顯活躍，但成骨細(xì)胞活動無增加，從而造成了成骨活動落后于破骨活動，股骨頭形態(tài)表現(xiàn)出明顯的吸收表現(xiàn)。筆者認(rèn)為這正是股骨頭出現(xiàn)形態(tài)改變的原因。

與其他學(xué)者的報道［4，8-10］類似，本研究的前期研究中發(fā)現(xiàn)單獨應(yīng)用唑來膦酸治療股骨頭壞死，可以通過抑制破骨細(xì)胞的活動以及新生血管的形成而影響死骨的修復(fù)過程，但與安慰劑組股骨頭內(nèi)大量活骨存在相比，股骨頭內(nèi)仍以死骨表現(xiàn)為主，僅存在有限的修復(fù)反應(yīng)，對于股骨頭壞死后的成骨活動也有明顯的抑制［11］。組織學(xué)檢查顯示，由于二磷酸鹽對于修復(fù)反應(yīng)的抑制造成其治療后股骨頭內(nèi)死骨長期維持在無活力狀態(tài)，雖然保存了股骨頭的外形，但不是期望的恢復(fù)為具有良好排列和活力的健康狀態(tài)，若要維持治療效果必須進(jìn)行長期用藥。而且由于用藥后表現(xiàn)為破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和血管新生的全面抑制，所以其是降低了修復(fù)反應(yīng)的強(qiáng)度，但并未糾正修復(fù)反應(yīng)中成骨不足的失衡狀態(tài)。使用二磷酸鹽類進(jìn)行股骨頭壞死的治療，只是延長了病程，拖延了出現(xiàn)股骨頭塌陷的時間，并不會改變股骨頭壞死的結(jié)局，經(jīng)治療后仍會出現(xiàn)股骨頭的緩慢變形，甚至逐漸進(jìn)展至塌陷［5］。

NELL-1是一種新近發(fā)現(xiàn)的具有特異性促進(jìn)成骨細(xì)胞系分化的生長因子［12］。從分子機(jī)制上看，NELL-1直接受runt相關(guān)轉(zhuǎn)化因子2(Runx2/Cbfa1)的調(diào)控。而Runx2/Cbfa1是控制成骨細(xì)胞生成及其功能的主要調(diào)控基因［13-14］。NELL-1作為一種細(xì)胞分泌因子并更專一的作用于進(jìn)一步分化的成骨細(xì)胞系，因此NELL-1促進(jìn)成骨的作用可能比骨形態(tài)形成蛋白 (bone morphogenetic protein，BMP)更專一［14-15］。NELL-1 可以通過膜內(nèi)成骨和/或軟骨成骨促進(jìn)原位成骨。與BMP-2不同，NELL-1不會造成肌肉內(nèi)的異位成骨，其作用機(jī)制為促進(jìn)骨軟骨前體細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，提高成骨細(xì)胞的OPN、骨鈣素和BMP-7的表達(dá)，并促進(jìn)骨礦化提高骨質(zhì)量，相對于目前使用其他具有成骨活性因子的最大優(yōu)勢在于其特異性強(qiáng)，不會造成異位成骨［16］。NELL-1作用特異性在本研究中的優(yōu)勢表現(xiàn)明顯，在 Vandermeer等［5］的研究中即便采用BMP-2股骨頭內(nèi)局部給藥仍然發(fā)現(xiàn)存在異位骨化，而本研究則未發(fā)現(xiàn)異位成骨表現(xiàn)。

本研究在NELL-1聯(lián)合唑來膦酸應(yīng)用以后，體現(xiàn)為對破骨細(xì)胞的抑制和對成骨細(xì)胞的促進(jìn)，對血管新生也具有一定程度的促進(jìn)作用。NELL-1和唑來膦酸聯(lián)合應(yīng)用后通過抑制破骨細(xì)胞的活動以及促進(jìn)成骨細(xì)胞的活動和新生血管的形成而影響了死骨的修復(fù)過程。股骨頭內(nèi)以活骨表現(xiàn)為主，存在明顯的成骨細(xì)胞活動。X光照相測量股骨頭高度寬度比及大體形態(tài)均顯示其具有良好的預(yù)防股骨頭塌陷的作用，顯微CT顯示股骨頭形態(tài)較安慰劑組好，股骨頭內(nèi)無明顯囊性變，骨量及骨形態(tài)都保持良好。組織學(xué)觀察顯示NELL-1和唑來膦酸聯(lián)合應(yīng)用具有在維持股骨頭外形的情況下將股骨頭內(nèi)死骨置換為活骨的能力，從而有望實現(xiàn)骨壞死病程的逆轉(zhuǎn)。同時因為其調(diào)控作用由兩種因素協(xié)同完成，有望通過調(diào)整兩種治療因素的比例而實現(xiàn)對成骨/破骨的個體化調(diào)控，適應(yīng)于不同個體的病理狀態(tài)而實現(xiàn)個體化治療。

本研究為探索性研究，仍存在著不足，如未充分觀察NELL-1和唑來膦酸的作用周期、未觀察NELL-1基因轉(zhuǎn)染后成骨基因的改變、未觀察用藥對于全身其他部位/臟器可能存在的影響，同時因為本研究采用的動物模型為4足模型，髖關(guān)節(jié)負(fù)重較少，甚至在出現(xiàn)骨壞死之后可能基本不負(fù)重，且采用的為未成熟的動物模型，與成人機(jī)制不完全相同，所以本研究尚不能直接認(rèn)為其對于人類的股骨頭壞死治療同樣有效，仍需進(jìn)一步的后續(xù)研究。

綜上，筆者認(rèn)為NELL-1和唑來膦酸聯(lián)合應(yīng)用于大鼠創(chuàng)傷性骨壞死動物模型可以促進(jìn)成骨細(xì)胞活動，抑制破骨細(xì)胞活動，保存骨量和股骨頭形態(tài)，具有良好的預(yù)防股骨頭壞死塌陷的作用，有望實現(xiàn)骨壞死病程的逆轉(zhuǎn)。

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