周 建，葛寶豐，甄 平，馬小妮，閆麗娟，郭曉宇，成 魁，高玉海，石文貴，陳克明

中國人民解放軍蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科研究所，蘭州 730050

蛇床子是傘形科植物蛇床的果實，中醫(yī)認為其具有溫腎助陽、祛風(fēng)燥濕、殺蟲止癢之功效。明磊國等［1-3］研究顯示蛇床子素能促進體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞成骨性分化，以及促進成骨細胞的礦化成熟和抑制破骨細胞吸收活性，因此推測蛇床子素具有促進骨代謝的活性作用，但是缺少體內(nèi)和更接近體內(nèi)藥物代謝的實驗依據(jù)，因為藥物在體內(nèi)對骨骼調(diào)節(jié)是一個針對成骨、破骨、骨髓間充質(zhì)和骨細胞的復(fù)合體，本研究應(yīng)用體外大鼠股骨組織培養(yǎng)模型，此模型具有實驗簡單和藥物代謝過程更接近體內(nèi)藥物代謝的過程，因此本研究以雌二醇為陽性對照藥物從組織水平探討蛇床子素對體外培養(yǎng)股骨組織代謝活性的影響。

材料和方法

材料 實驗動物SPF級SD大鼠［甘肅省中醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，合格證號SCXK(甘)2010-0006-152］。胎牛血清 (蘭州民海生物公司);DMEM培養(yǎng)基、Ⅱ型膠原酶 (Gibco公司，美國);總RNA提取裂解液 Reagent kit、Prime ScriptTM SYBR?Premix Ex TaqTMⅡPCR擴增試劑盒 (大連寶生物公司);青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶 (Sigma公司，美國);2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉，蛋白定量試劑盒 (武漢博士德生物工程有限公司);堿性磷酸酶測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);鈣含量測定試劑盒(BioVision，美國);蛇床子素雌二醇為中國藥品生物制品檢定所提供的對照品 (純度＞99%);其余試劑均為分析純。

大鼠股骨組織的培養(yǎng) 實驗大鼠購于甘肅省中醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，取1月齡 (80±5)g SD雄性大鼠6只，處死后放入75%酒精浸泡10 min，取股骨，去除肌肉、血管及結(jié)締組織，用無菌PBS沖洗骨髓腔，棄掉骨髓，然后將股骨剪成約1 mm3的骨片，PBS反復(fù)沖洗骨片，棄掉沖洗液后，然后0.25%的胰蛋白酶消化10 min，徹底去除軟組織，棄掉消化液，然后用無菌PBS漂洗兩次，用含有10%胎牛血清的DMEM(4.5 g/L葡萄糖)培養(yǎng)液37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液1次，具體培養(yǎng)方法參考文獻 ［4］。

最佳藥物濃度篩選 在股骨組織培養(yǎng)48 h后采用不同濃度 (1×10-4～1×10-8mol/L)雌二醇和蛇床子素分別處理體外培養(yǎng)的大鼠股骨組織，在藥物處理后第9天PBS漂洗骨片，加入1.5 ml組織裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2、150 mmol/L NaCl、100 mg/L苯甲基磺酰氟、1 mg/L抑蛋白酶肽、1%Tween-100、0.5%去氧膽酸鈉)，用勻漿器勻漿股骨組織成乳液狀，然后超聲處理15 s，低溫靜置30 min后1000 r/min離心5 min(轉(zhuǎn)子半徑6 cm)，棄掉沉淀，Bradford法測定蛋白濃度，具體操作嚴格按照說明書進行，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中蛋白濃度，然后取相同質(zhì)量的總蛋白分別測定各組堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase，ALP)活性，ALP活性測定按試劑盒說明書進行，每組分別按緩沖液∶基質(zhì)液=1∶1加入充分搖勻;37℃水浴15 min，加入3倍于基質(zhì)液顯色液，充分混勻顯色后，測定502 nm處吸光度值，經(jīng)過計算換算ALP活性 (U/g蛋白)［5］，每個濃度3次平行實驗，每次6個重復(fù)。

分組處理 在骨組織培養(yǎng)48 h后，隨機編號分為3組，分別為含終濃度為1×10-5mol/L蛇床子素組、含終濃度為1×10-8mol/L雌二醇組和對照組。

ALP活性測定 在加藥后的第3、6、9、12、15和18天PBS漂洗骨片，方法同最佳藥物濃度篩選和ALP活性的測定方法。

鈣含量測定 體外培養(yǎng)的股骨組織加蛇床子素處理后的第3、6、9、12、15和18天，PBS漂洗骨片，然后將骨片放入烘箱中100℃烘烤48 h，烘烤后稱量其干重。再向骨片中加入1 ml 1 mol/L的鹽酸勻漿，用勻漿器勻漿股骨組織后振蕩過夜，消化液1000 r/min離心5 min(轉(zhuǎn)子半徑6 cm)取上清液。測定鈣鹽含量，樣本測定按照說明書操作步驟進行。每孔加入50 μl上清液，然后樣本及標(biāo)準(zhǔn)孔加入90 μl的顯色基質(zhì)液，充分混勻后加入60 μl的鈣含量分析緩沖液，室溫下反應(yīng)10 min，570 nm處測定吸光度值。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本中鈣含量，結(jié)果表示為:測定勻漿中鈣的總質(zhì)量/烘干后大鼠股骨組織的質(zhì)量。

基因表達水平分析

總RNA提取:骨片在蛇床子素處理培養(yǎng)后的第3、6、9、12、15和18天后棄培養(yǎng)液，無酶PBS漂洗2次，加入1 ml總RNA提取裂解液，裂解勻漿骨片，收集勻漿液，1000 r/min離心5 min，取上清液加入200 μl氯仿4℃ 12 000 r/min離心15 min(轉(zhuǎn)子半徑1.5 cm)，取上清液加入等體積的異丙醇靜置15 min，4℃12 000 r/min離心15 min(轉(zhuǎn)子半徑1.5 cm)棄上清液，75%乙醇重懸浮沉淀4℃ 12 000 r/min離心5 min(轉(zhuǎn)子半徑1.5 cm)，棄上清后-70℃保存，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，在230、260、280和320 nm處測定吸光度值，調(diào)整總RNA的濃度。

逆轉(zhuǎn)錄:使用Prime ScriptTMreagent Kit(TakaRa Code:DRR037A)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成反轉(zhuǎn)錄出第一條cDNA鏈。反應(yīng)體系:5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶1.0 μl，多聚 T 引物 (50 μmol/L)1.0 μl，隨機引物(100 μmol/L)1.0 μl，總 RNA 10 μl(1000 ng)補無酶水至20 μl。37℃反應(yīng)15 min，85℃ 5 s，-20℃保存。

引物設(shè)計:根據(jù)實驗要求，在GenBank查詢所需要基因的目的序列mRNA序列，引物均由寶生物 (大連)公司根據(jù)序列設(shè)計并合成。人類相關(guān)轉(zhuǎn)錄基因2:NM_053470.1上游引物5’-GCACCCAGCCCATAATAGA-3’，下游引物 5’-TTGGAGCAAGGAGAACCC-3’，產(chǎn)物長度165 bp;核因子κB受體活化因子配體:NM_053356上游引物 5’-TTCCCGGTGAATTCGGTCTC-3’，下游引物 5’-ACCTCGGATTCCAATAGGACCAG-3’，產(chǎn)物長度107 bp;骨保護素 (osteoprotegerin，OPG):NM_057149.1上游引物5’-GCAGCATCGCTCTGTTCCTGTA-3’，下游引物 5’-GCATGAGTCAGGTAGTGCTTCTGTG-3’，產(chǎn)物長度164 bp;GAPDH:NM_017 008.3上游引物5’-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’，下游引物 5’-ATG GTGGTGAAGACGCCAGTA-3’，產(chǎn)物長度143 bp。

PCR反應(yīng)體系:為20 μl，包括:SYBR Premix Ex Taq TMⅡ (2 × )10 μl; 上游引物(10 μmol/L)0.8 μl;下游引物 (10 μmol/L)0.8 μl;ROX參照熒光 (50×)0.4 μl;cDNA 模板 2 μl;dH2O 6 μl。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s，60℃退火31 s，進行40個循環(huán)，每個循環(huán)收集熒光信號。隨后緩慢升溫，95℃15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，溫度變化速度為0.1℃/s，繪制PCR產(chǎn)物的溶解曲線，了解擴增的特異性。

實時熒光定量RT-PCR數(shù)據(jù)分析:采用△△Ct處理數(shù)據(jù)，2-△△Ct表示數(shù)據(jù)的結(jié)果，具體方法參考文獻 ［6］。

統(tǒng)計學(xué)處理 所有統(tǒng)計分析均采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件完成，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。首先用方差分析檢驗各組間差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義，當(dāng)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義時，用多參數(shù)t-檢驗驗證各均數(shù)間差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

最佳藥物濃度 最佳的藥物濃度為:蛇床子素1×10-5mol/L、雌二醇1×10-8mol/L(圖1)。

蛇床子素對ALP活性的影響 蛇床子素組和雌二醇組ALP活性第3～9天呈升高趨勢，第9～18天降低，第9天達到最高;與對照組相比，蛇床子素組和雌二醇組在第3、6和9天顯著高于對照組 (P＜0.01);但在第12、15和18天時，蛇床子素組和雌二醇組ALP活性與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(圖2)。

蛇床子素對鈣鹽沉積量的影響 第3、6、15、18天蛇床子素組和雌二醇組鈣鹽含量顯著高于對照組(P＜0.05，P＜0.01)，第12天顯著低于對照組(P＜0.01)，第9天3組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)(圖3)。

成骨性基因表達 蛇床子素組和雌二醇組第3～6天逐漸升高，第6～18天逐漸降低，第6天時達到最高。蛇床子素組和雌二醇組在處理股骨組織第3、6、9和15天時顯著促進Runx-2 mRNA的表達 (P＜0.05，P＜0.01)，處理第12天時顯著抑制 Runx-2 mRNA的表達 (P＜0.01)(圖4)。

圖1 用堿性磷酸酶活性篩選最佳的藥物濃度Fig 1 The optimal doses of osthole and estradiol were screened based on alkaline phosphatase activity

圖2 藥物處理股骨組織3、6、9、12、15和18 d堿性磷酸酶活性測定Fig 2 The alkaline phosphatase activity was measured 3，6，9，12，15，and 18 day after drug treatment

圖4 蛇床子素和雌二醇對股骨組織人類相關(guān)轉(zhuǎn)錄基因-2 mRNA的表達Fig 4 The Runx-related gene-2 mRNA expression in femur tissues after osthole and estradiol treatment

蛇床子素組和雌二醇組在處理股骨組織第3、9、15天時顯著促進OPG mRNA的表達 (P＜0.05，P＜0.01)，在第6和12天時能顯著抑制OPG mRNA的表達 (P＜0.05)(圖5)。

蛇床子素組和雌二醇組在處理股骨組織第6和9天時能顯著促進核因子κB受體活化因子配體 mRNA的表達 (P＜0.01)，第3、12、15和18天時能顯著抑制核因子κB受體活化因子配體mRNA的表達 (P＜0.05，P ＜0.01)(圖6)。

蛇床子素組和雌二醇組在處理股骨組織第6和15天時能顯著促進骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 mRNA的表達 (P＜0.01)，第9和12天時能顯著抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 mRNA的表達 (P＜0.01)。蛇床子素組在第3和18天時與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)。雌二醇組處理第18天時能顯著抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 mRNA的表達 (P＜0.05)，第3天時與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)(圖7)。

圖5 蛇床子素和雌二醇對股骨組織骨保護素mRNA的表達Fig 5 The osteoprotegerin mRNA expression in femur tissues after osthole and estradiol treatment

圖6 蛇床子素和雌二醇對股骨組織核因子κB受體活化因子配體mRNA的表達Fig 6 The receptor activator of nuclear factor-κB ligand mRNA expression in femur tissues after osthole and estradiol treatment

圖7 蛇床子素和雌二醇對股骨組織骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 mRNA的表達Fig 7 The bone morphogenetic protein-2 mRNA expression in femur tissues after osthole and estradiol treatment

討 論

有報道終濃度為1×10-5mol/L蛇床子素能促進骨髓間充質(zhì)細胞成骨性分化［1］，抑制破骨細胞的成熟［2-3］。本研究在已有的股骨組織體外培養(yǎng)模型的基礎(chǔ)上［4］，應(yīng)用骨組織體外培養(yǎng)模型進行蛇床子素體外代謝活性研究，此模型快速、簡便，實驗結(jié)果接近體內(nèi)試驗結(jié)果。目前研究比較清楚的雌二醇具有抗骨質(zhì)疏松作用，因此本研究以雌二醇為陽性對照藥物，通過檢測各項指標(biāo)，確保股骨組織體外培養(yǎng)模型的可行性和恰當(dāng)性。在體外培養(yǎng)的股骨組織水平篩選了最佳的藥物濃度，蛇床子素和雌二醇的最佳濃度分別為1×10-5mol/L和1×10-8mol/L，本研究采用終濃度為1×10-5mol/L蛇床子素對體外培養(yǎng)大鼠股骨組織進行干預(yù)，以研究蛇床子素對體外培養(yǎng)的大鼠股骨組織骨形成活性的調(diào)節(jié)，檢測蛇床子素處理后股骨組織中ALP的活性、鈣含量以及骨形成活性的相關(guān)基因的表達。

ALP的活性是檢測成骨細胞早期分化的標(biāo)志性指標(biāo)以及骨形成活性的標(biāo)志性指標(biāo)［7］，有研究顯示蛇床子素和雌二醇能顯著促進體外培養(yǎng)成骨細胞ALP活性［1］。本研究顯示蛇床子素組和雌二醇組的ALP活性從第3～9天顯著高于對照組，第12天活性降低，這可能與ALP是一個骨形成的早期指標(biāo)有關(guān)。鈣鹽是骨骼的主要成分，因此鈣鹽的沉積量也就成了衡量骨代謝活性的一個重要指標(biāo)，本研究觀察了蛇床子素和雌二醇對體外培養(yǎng)股骨組織鈣含量的影響，在體外培養(yǎng)股骨組織第3天時鈣的沉積達到最高，從第6～18天蛇床子素處理組鈣含量基本保持在一個相對恒定的水平，但第9和12天之間鈣鹽是一個關(guān)鍵的時間點鈣鹽，蛇床子素先是促進Ca的沉積，到抑制鈣鹽沉積，再到第15天時促進鈣鹽沉積，因此筆者推測蛇床子素能維持骨骼的代謝活性處在一個相對穩(wěn)定的水平，但促進Ca的沉積存在時效關(guān)系。

骨骼的代謝過程受到多種基因和蛋白的調(diào)控，因此本研究檢測不同時間點體外培養(yǎng)股骨組織中Runx-2、RANKL、OPG、BMP-2 mRNA含量的水平，以期望從基因水平檢測蛇床子素對體外培養(yǎng)股骨組織代謝活性的影響差異。其中，Runx-2是一個重要的成骨的轉(zhuǎn)錄因子，在骨代謝活性中發(fā)揮重要作用［8］。本研究顯示蛇床子素和雌二醇能促進Runx-2的表達，但是先是升高之后降低;RANKL和OPG是一對骨形成與骨吸收的關(guān)鍵性基因，但OPG升高時骨形成大于骨吸收，當(dāng)RANKL升高時骨吸收大于骨形成［9-12］，本研究表明蛇床子素和雌二醇在體外培養(yǎng)股骨組織先是抑制、之后促進、然后又抑制RANKL mRNA表達水平的過程，蛇床子組對OPG mRNA表達水平先是促進、之后抑制、然后促進，表明蛇床子素和雌二醇對體外培養(yǎng)先是促進骨形成、然后促進骨吸收、然后促進骨形成的過程，因此可能是蛇床子素促進骨形成和骨吸收存在一個時效關(guān)系。BMP-2作為骨代謝活性的一個重要的活性因子［13］，結(jié)果表明BMP-2的表達水平先升高、然后逐漸降低、又升高，進一步表明蛇床子素和雌二醇對骨形成調(diào)節(jié)存在一個時效關(guān)系。

本研究在組織水平上探討蛇床子素對體外培養(yǎng)的股骨組織活性的影響，通過對不同時間點ALP活性、鈣含量骨代謝相關(guān)基因表達水平檢測，證明蛇床子素能調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)的股骨組織的骨代謝活性，綜合各項檢測指標(biāo)，蛇床子素能調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)股骨組織的代謝活性，但是各項指標(biāo)表明在藥物處理后的第9和12天是蛇床子素調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收的一個關(guān)鍵時間點，即蛇床子素調(diào)節(jié)骨代謝存在一個時效效應(yīng)。有關(guān)蛇床子素對體外培養(yǎng)大鼠股骨組織代謝活性調(diào)節(jié)的研究報道較少，因此本研究在組織水平為蛇床子素調(diào)節(jié)骨代謝活性提供了一定的實驗證據(jù)。

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