潘曉霞， 李靜靜， 何文森， 李大力， 賈承勝， 張曉鳴， 馮 骉*

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.南京理工大學 化工學院，江蘇 南京210094）

乙基香蘭素（Ethyl vanillin），學名3-乙氧基4-羥基苯甲醛，具有強烈的香子蘭氣味，香氣強度為同量香蘭素的3.5倍[1]，且香氣更為爽快、幽雅，是重要的光譜型高檔香料，其香氣闕值為100[2]，廣泛應用于食品、煙草、日用品中，也是重要的醫(yī)藥中間體。目前乙基香蘭素的價格是香蘭素的2倍左右，在食品、飲料、酒類等行業(yè)中，其添加量不到香蘭素的三分之一，是取代香蘭素的有效添加劑[3]。

到目前為止，乙基香蘭素的天然來源尚無報道，市售產(chǎn)品均由化學法合成，主要以鄰乙氧基苯酚為原料，合成過程存在收率低、污染嚴重等問題[4]。隨著生物技術的不斷發(fā)展，通過生物方法獲取芳香化合物已成為近年來行業(yè)研究的熱點[5-7]。用生物轉化法生產(chǎn)香蘭素的研究已經(jīng)有十余年的歷史，研究者采用了多種生物材料，包括真菌[8]、細菌[9-10]、基因工程菌[11]、植物細胞[12]及提取得到的酶[13]，研究了各種微生物、植物細胞內合成和降解香蘭素的代謝途徑。但是，對乙基香蘭素的生物合成少有研究。作者提出了一條全新的生物催化合成乙基香蘭素的途徑，見圖1。

圖1 乙基香蘭素生物催化途徑Fig.1 Proposed route for synthesis of ethyl vanillin

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

惡臭假單胞桿菌 （Pseudomonasputida ATCC12633）；pET-28a（+）：作者所在實驗室保存；重組大腸桿菌 BL21（DE3）（pET30a-mdlB）：作者所在實驗室構建；受體大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）：作者所在實驗室保存。

1.2 工具酶與試劑（盒）

T4DNA連接酶、dNTP、限制性內切酶 NcoI，BamHⅠ：Fermentas公司產(chǎn)品；Taq plus DNA聚合酶，IPTG，卡那霉素，柱式質粒小量抽提試劑盒，柱式DNA膠回收試劑盒及柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒：上海生工生物有限公司產(chǎn)品；引物合成和DNA測序：上海生工生物有限公司承擔；乙基香蘭素標準品：Sigma公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純國產(chǎn)或進口試劑。

1.3 實驗方法

1.3.1 mdlC基因PCR擴增 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中Pseudomonas putida中的苯乙酮酸脫羧酶基因mdlC的序列設計引物，引物序列如下：Primer1為5’-CACACCATGGTGGCTTCGGTACACGGCAC-3’， 下劃 線 部 分 為 NcoI位 點 ，Primer2為 5’-CTAGGATCCTCACTTCACCGGGCTTACG-3’，下劃線部分為 BamHⅠ位點，以Pseudomonas putida ATCC12633為DNA模板。反應條件：95℃預變性3 min；94℃變性 30 s，56℃復性 30 s，72℃延伸 2 min，30個循環(huán)；72℃再延伸10 min。反應結束取樣5 μL，用質量分數(shù)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，以標準核酸分子為對照。PCR產(chǎn)物按PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明書所述方法進行回收。

1.3.2 重組質粒的構建 利用NcoI和BamH I對質粒 pET-28a（+）進行雙酶切，按DNA膠回收試劑盒說明書所述方法割膠回收線性載體片段。將純化后的PCR擴增產(chǎn)物與線性載體片段用T4DNA連接酶于16℃連接過夜，連接產(chǎn)物導入大腸桿菌感受態(tài)細胞 DH5α，涂布于含卡那霉素（50 μg/mL）的 LB平板上。挑取單菌落至含卡那霉素（50 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，對重組子進行菌液PCR和Nco I/BamH I雙酶切鑒定。陽性重組質粒由上海生物工程有限公司完成測序。

1.3.3 目的基因mdlC在大腸桿菌中的誘導表達重組質粒轉入感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3），涂布于含卡那霉素（50 μg/mL）的LB平板上。重組子鑒定同 1.2.2。 挑取菌落 E.coli BL21 （DE3）（pET28amdlC）接種于含卡那霉素（50 μg/mL）的 LB 液體培養(yǎng)液中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至A600nm=0.4～0.6，添加IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，將溫度降至30℃后繼續(xù)培養(yǎng)6 h，離心收集菌體，磷酸鹽緩沖溶液（pH7.0）洗滌1～2次后，用等體積的超純水重懸菌體，取 100 μL 菌液，加入 20 μL 5×上樣緩沖液，沸水浴加熱5 min后，取10 μL進行SDS-PAGE全細胞蛋白電泳分析。同時，以未誘導的重組菌和含pET28a（+）空載體的重組菌為對照。

1.3.4 重組大腸桿菌發(fā)酵能力的鑒定 以乙基扁桃酸為底物，重組菌E.coli BL21（DE3）（pET30amdlB）為催化劑，將乙基扁桃酸催化脫氫，制備含有3-乙氧基-4-羥基苯乙酮酸的轉化液，并以苯乙酮酸為底物作為對照組。

根據(jù)1.2.3方法誘導18 h后，離心收集重組菌E.coli BL21（DE3）（pET30a-mdlB），用磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）洗滌細胞兩次，細胞重懸于含底物5 g/L的乙 基 扁 桃 酸 的 轉 化 液 （6 g/L Na2HPO4，3 g/L KH2PO4，0.5 g/L NH4Cl，0.3 g/L MgSO4，pH 7.0）中，于30℃，200 r/min催化24 h后離心，除去菌體，收集含有3-乙氧基-4-羥基苯乙酮酸的轉化液。

同樣的方法制備靜息細胞E.coli BL21（DE3）（pET28a-mdlC），將收集到的菌體重懸于上述含3-乙氧基-4-羥基苯乙酮酸的轉化液中，于30℃，200 r/min催化24 h，用高效液相色譜（HPLC）檢測反應液中的物質的濃度。

1.3.5 重組大腸桿菌催化合成乙基香蘭素 同1.2.4方法分別制備靜息細胞 E.coli BL21（DE3）（pET30a-mdlB）和 E.coli BL21 （DE3）（pET28amdlC），等質量混合，混合細胞重懸于含5 g/L乙基扁桃酸的轉化液中，同樣的條件催化24 h，用HPLC檢測反應液中的物質的濃度。

1.3.6 分析方法 取5 mL轉化液，離心除去菌體，0.22 μL針頭過濾器過濾上清，用高效液相色譜儀分析，色譜條件為：色譜柱為Atlantis-C18反相柱（5 μm，3.9 mm×150 mm）， 柱溫 30℃， 流量 0.6 mL/min，進樣量 5 μL，流動相：V（甲醇）∶V（水）∶V（甲酸）=70∶30∶0.1，紫外檢測器，波長 280 nm。

1.3.7 產(chǎn)物的紅外分析 反應結束后，離心去除菌體，將反應液調至pH 6，用等體積的乙酸乙酯萃取1～2次，反應液中的乙基香蘭素幾乎全部轉移至有機相，而未反應的底物乙基扁桃酸留于水相。減壓蒸餾去除有機相，真空干燥得到淡黃色的乙基香蘭素固體，將其復溶于45℃的水中，恒溫振蕩至乙基香蘭素全部溶解，置于4℃冰箱，析出得到白色固體。50℃烘箱干燥去除殘留水分，所得的固體經(jīng)KBr壓片后，進行紅外分析，光譜掃描范圍為4 000～600 cm-1，掃描次數(shù)為 32，分辨率為 4 cm-1，以乙基香蘭素標準品作為對照。

2 結果與討論

2.1 重組質粒的構建與目的基因的表達

2.1.1 mdlC基因PCR擴增結果 以Pseudomonas putida ATCC12633為 DNA模板，經(jīng)PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)質量分數(shù)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，如圖2所示，得到一條大小約為1 600 bp的DNA條帶，與理論值（1 606 bp）相符。

圖2 苯乙酮酸脫羧酶基因（mdlC）的PCR擴增產(chǎn)物Fig.2 PCR products of mdlC gene

2.1.2 重組表達載體的酶切鑒定、PCR鑒定 以含重組質粒pET28a-mdlC的大腸桿菌DH5α為DNA模板，進行菌液PCR鑒定，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖3所示，泳道3～8都出現(xiàn)與mdlC基因片段（泳道1）大小一致的DNA特異性條帶，且PCR結果沒有雜帶顯示，經(jīng)陰性對照（泳道2）表明，在沒有模板的情況下沒有特異性目的片段出現(xiàn)。已初步確定所挑選的菌株都插入目的基因。為了進一步確定目的片段已經(jīng)連接上載體，抽提含有目的基因的重組菌質粒，對重組克隆載體進行Nco I和BamH I雙酶切鑒定，以空載體pET28a（+）作為對照，結果如圖4所示，泳道1為空載體pET28a（+）雙酶切后得到，在約5 300 bp處出現(xiàn)一條帶，泳道3～8出現(xiàn)兩條帶，其中一條與沒有連接外源基因的空質粒雙酶切得到的條帶大小一致，另一條與純化后的PCR產(chǎn)物（泳道2）大小一致，測序結果與GenBank中的mdlC序列一致性為100%。以上結果顯示已成功構建了重組質粒pET28amdlC。

圖3 菌液PCR擴增的結果Fig.3 Results of bacteria PCR

圖4 重組質粒pET28a-mdlC雙切酶鑒定（Nco I/BamH I）Fig.4 Results of pET28a-mdlC digested by Nco I and BamH I

2.1.3 誘導產(chǎn)物的SDS-PAGE分析 SDS-PAGE電泳結果（圖5）顯示：含有重組質粒pET28a-mdlC的重組菌（泳道2）經(jīng)IPTG誘導在約57 000處產(chǎn)生一條明顯的蛋白質電泳帶，與文獻報道的重組蛋白大小相符[14]，表明mdlC基因在宿主大腸桿菌BL21（DE3）中得到有效表達。未經(jīng)誘導的重組菌（泳道1）和含空載體的菌株（泳道3、4）并沒有目的蛋白的表達。所以本研究構建的重組大腸桿菌E.coli BL21（DE3）（pET28a-mdlC）在IPTG的誘導下能夠很好地表達苯乙酮酸脫羧酶，且只有在誘導劑存在的條件下，基因mdlC才能夠表達。

圖5 E.coli BL21（DE3）（pET28a-mdlC）全細胞蛋白電泳圖Fig.5 SDS-PAGE of total proteins of E.coli BL21（DE3）（pET28a-mdlC）

2.1.4 重組菌 E.coli BL21（DE3）（pET28a-mdlC）的發(fā)酵性能鑒定 利用重組菌 E.coli BL21（DE3）（pET30a-mdlB）生物催化5 g/L乙基扁桃酸脫氫合成中間產(chǎn)物3-乙氧基-4-羥基苯乙酮酸，催化24 h后得到2.46 g/L 3-乙氧基-4-羥基苯乙酮酸，表明（S）-扁桃酸脫氫酶將所有的 （S）-乙基扁桃酸全部脫氫氧化。

重組菌 E.coli BL21 （DE3）（pET28a-mdlC）在IPTG的誘導下，成功表達了具有酶活性的苯乙酮酸脫羧酶，如圖6所示，隨著催化時間的延長，反應液中3-乙氧基-4-羥基苯乙酮酸逐漸減少，乙基香蘭素逐漸增多，在催化24 h后轉化液中已經(jīng)檢測不到3-乙氧基-4-羥基苯乙酮酸，得到乙基香蘭素約2 g/L，即在沒有優(yōu)化的條件下，苯乙酮酸脫羧酶將底物全部脫羧產(chǎn)生乙基香蘭素和CO2，高效液相色譜-質譜聯(lián)用（LC-MS）檢測顯示，沒有任何副產(chǎn)物產(chǎn)生。對于陰性對照組 E.coli BL21（DE3）（pET28a（+）），在反應過程中，底物 3-乙氧基-4-羥基苯乙酮酸的質量濃度保持不變，且沒有乙基香蘭素產(chǎn)生。

圖6 重組菌 E.coli BL21（DE3）（pET28a-mdlC）對 3-乙氧基-4-羥基苯乙酮酸的生物轉化Fig.6 Time courses of biotransformation with E.coliBL21（DE3）（pET28a-mdlC）in the presence of 4-hydroxy-3-ethoxybenzoylformate

2.2 生物轉化乙基香蘭素

2.2.1 混合靜息細胞生物轉化 作者采用靜息細胞轉化法，即利用微生物整體作為反應催化劑對外源底物進行結構修飾[15]。1.2.4所述的生物轉化需要兩步反應如圖1，利用細胞內的扁桃酸脫氫酶和苯乙酮酸脫羧酶聯(lián)合作用催化底物合成乙基香蘭素。作者提出了一種新的方法代替上述的兩步法生物催化合成目的產(chǎn)物，分別將兩株重組大腸桿菌培養(yǎng)至一定階段后，加入誘導劑，使目的蛋白得到有效表達，當細胞內積累一定量的目的蛋白時，將兩株重組菌離心分離，等質量混合，將其重新懸浮于轉化液，使其處于不再生長但仍保持原有各種酶活的狀態(tài)，添加底物5 g/L乙基扁桃酸，在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下進行轉化。每隔4 h取樣，用HPLC檢測反應液中物質的質量濃度，發(fā)現(xiàn)檢測不到中間產(chǎn)物3-乙氧基-4-羥基苯乙酮酸，可能是由于中間產(chǎn)物3-乙氧基-4-羥基苯乙酮酸的轉化速率高于乙基扁桃酸的脫氫速率，表明扁桃酸脫氫酶的催化速率是該反應速率的限制因素。底物乙基扁桃酸和產(chǎn)物乙基香蘭素的質量濃度變化如圖7所示，隨著反應時間的延長，乙基香蘭素逐漸增多，當反應24 h后，乙基香蘭素質量濃度為1.94 g/L，與2.1.4得到的結果一致，相對應的摩爾轉化率為50%。因此，利用混合細胞催化合成乙基香蘭素不僅得到了與上述兩步法反應一致的結果，還縮短了一半的反應時間，提高了反應效率。

圖7 混合細胞生物催化反應液中的乙基扁桃酸和乙基香蘭素的質量濃度變化Fig.7 Time courses of on the bioconversion of 4-hydroxy-3-ethoxymandelic acid to ethylvanillin with resting cells of two recombinant E.coli strains

2.2.2 混合靜息細胞重復利用 眾多研究者曾比較生長細胞與靜息細胞催化法合成目的產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)利用靜息細胞生物轉化可以有效地控制轉化液的組成，以適應底物轉化的最佳條件[15]，同時減少了培養(yǎng)基成分對轉化過程的影響，減少染菌的概率[16]，便于后期轉化產(chǎn)物的分離與提純[17]；可以提高細胞濃度，以便縮短反應時間[18]；具有利用底物能力強，轉化率高、反應時間短等優(yōu)點[19-20]。作者對靜息細胞的重復使用次數(shù)做了試驗，結果如圖8所示，前3次靜息細胞保持其生物活性，乙基香蘭素產(chǎn)率盡管有輕微減少，但均維持在45%以上，可能是由于在重復操作過程中，細胞有所損失，使得細胞濃度略有減少[18]。增加重復使用次數(shù)，乙基香蘭素的產(chǎn)率逐漸下降，當重復第6次時，乙基香蘭素產(chǎn)率下降至25%以下。

圖8 靜息細胞作為生物催化劑的重復利用Fig.8 Repeated utilization of cells as biocatalyst

2.3 產(chǎn)物的結構鑒定

圖9中A和B分別為乙基香蘭素標準品和催化產(chǎn)物的紅外光譜，可以看出，兩者的峰形基本一致，主要基團的特征吸收峰為：3 356 cm-1為酚羥基的伸縮振動吸收峰；1 689 cm-1為C=O的伸縮振動吸收峰；1 575 cm-1，1 510 cm-1為苯環(huán)的 C=C骨架振動吸收峰；1 283 cm-1，1 163 cm-1為Ar-OH的CO伸縮振動吸收峰；1 258 cm-1，1 040 cm-1為苯環(huán)與OCH2中的C-O伸縮振動吸收峰；836 cm-1，784 cm-1為苯環(huán)l、2、4位取代特征吸收峰。

圖9 乙基香蘭素的紅外光譜Fig.9 IR spectrum of ethyl vanillin

3 結語

利用基因工程技術，成功地將苯乙酮酸脫羧酶基因克隆到pET28a（+）質粒載體上，重組質粒轉入到大腸桿菌BL21（DE3）中，能夠有效的表達可溶性目的蛋白。利用混合靜息細胞作為生物催化劑，對乙基扁桃酸脫氫氧化、脫羧合成乙基香蘭素。同時試驗表明，該混合靜息細胞可以重復使用至少3次，有效縮短了反應時間，提高反應效率。

采用微生物靜息細胞對乙基扁桃酸進行生物轉化合成乙基香蘭素的研究尚未見相關報道，作者在這一方面做了一些探索，提出了一種全新的合成乙基香蘭素的方法。今后將在優(yōu)化反應條件，提高產(chǎn)物的質量及作用機理方面展開進一步研究。

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