金征宇， 王金鵬， 柏玉香

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122）

環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)主要是由環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶催化淀粉制備而得。自從日本率先在20世紀(jì)70年代實現(xiàn)環(huán)糊精工業(yè)化生產(chǎn)之后，美國、德國、荷蘭、匈牙利及中國相繼發(fā)展了工業(yè)化生產(chǎn)環(huán)糊精的技術(shù)。目前為止，歐美在產(chǎn)量上已與日本不相上下，世界上主要生產(chǎn)環(huán)糊精的廠商有匈牙利的Cyclolab、法國的 Cerestar、德國的 Wacker Biochem以及日本的Ensuiko Sugar。據(jù)調(diào)查統(tǒng)計，近幾年環(huán)糊精國際市場產(chǎn)量呈25%的趨勢增長。如圖1顯示，環(huán)糊精世界生產(chǎn)量由2007年的16.38萬噸已迅速增長至2011年的40萬噸，并且隨著環(huán)糊精在醫(yī)藥、食品、化妝品及其它行業(yè)的應(yīng)用面的不斷擴大，世界環(huán)糊精市場將會保持超高速增長，預(yù)計年增長率將高達(dá)20%～25%。

圖1 世界環(huán)糊精生產(chǎn)量趨勢圖Fig.1 Trendency of cyclodextrin yield in the world

然而，正如筆者在文獻[1]中所提，在目前β-CD的工業(yè)化生產(chǎn)中，原料轉(zhuǎn)化率都局限在50%～60%之間，很難有進一步的提高[1]，α-CD及γ-CD的轉(zhuǎn)化率則更低，長期以來取得的突破非常有限，究其原因，主要由于環(huán)糊精制備過程影響因素眾多且難以掌握。研究者集中了大量的精力對環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶（CGTase）進行高效、高專一性的篩選，并在此基礎(chǔ)上對酶本身進行專一性改造[1]，取得了很好的進展，但在實際生產(chǎn)過程中，除了篩選一種低水解活性的高效生產(chǎn)用酶，以達(dá)到高效生產(chǎn)環(huán)糊精的目的外，通過控制反應(yīng)過程影響因素，從而增加環(huán)糊精產(chǎn)率的方法更有實際價值[2-4]。

作者從CGTase作用淀粉的催化機理分析入手，總結(jié)了CDs制備過程中的影響因素，結(jié)合現(xiàn)有CDs制備工藝，對環(huán)糊精制備過程研究提出展望。

1CGTase的結(jié)構(gòu)與催化機制

荷蘭格羅寧根大學(xué)的Dijkhuizen小組通過對來源于 Bacillus circulans（strain 251）的 CGTase 晶體結(jié)構(gòu)的分析研究，以及與他人的研究結(jié)果進行比對，發(fā)現(xiàn) CGTase大致包括 A、B、C、D、E 5 個活性區(qū)域（見圖2）[5]。其中A區(qū)域為α淀粉酶家族成員共有的TIM筒狀區(qū)域；B、C區(qū)域負(fù)責(zé)酶的活性中心的架構(gòu)以及酶與底物的結(jié)合；D區(qū)域是CGTase特有的區(qū)域，作用機理尚不明確，有研究認(rèn)為它負(fù)責(zé)輔助E區(qū)域的定位，間接影響整體酶活；而E區(qū)域則攜帶了多個麥芽糖基結(jié)合位點（MBS），在整個催化過程中起到結(jié)合反應(yīng)底物并引導(dǎo)直鏈糊精進入B域活性中心的作用[6]。

研究者以底物麥芽低聚糖中的葡萄糖基為參照，標(biāo)記了酶與底物的結(jié)合亞位點，分別為+2、+1、-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7 這 9 個亞位點。 其中+2、+1為受體亞位點，-1為催化亞位點，-2～-7為受體亞位點，且受體亞位點與-1～-7之間以共價中間體的形態(tài)存在。只有當(dāng)環(huán)化前伴隨耦合反應(yīng)時，才會產(chǎn)生+2～-7或+1～-7的8個或9個葡萄糖單元的環(huán)狀糊精。由于耦合活性遠(yuǎn)低于環(huán)化活性，故來源于Bacillus circulans（strain 251）的 CGTase的主要產(chǎn)物為-1～-7 構(gòu)成的 β-CD[7]。

圖2 CGTase的3種催化反應(yīng)Fig.2 Three reaction of CGTase

然而，一些不同來源的CGTase可能會具有不同個數(shù)的供體、受體亞位點，以及多個活性催化位點，會導(dǎo)致主要產(chǎn)物為其他聚合度的單一環(huán)糊精（例如，來源于Alkalophilic Bacillus sp.G-825-6的CGTase主要產(chǎn)物為γ-CD；以及來源于Thermococcus sp.B1001的CGTase主要產(chǎn)物為α-CD）或多個聚合度的環(huán)糊精（例如，來源于Bacillus circulans DF 9R 的 CGTase主要產(chǎn)物為 α、β-CD；以及來源于Bacillus firmus 290-3的CGTase主要產(chǎn)物為 β、γ-CD）[8-9]。

除常規(guī)的水解活性外，CGTase還具備了3種重要的催化活性：歧化、耦合和環(huán)化。其中，歧化現(xiàn)象只發(fā)生在CGTase催化的雙底物反應(yīng)中。根據(jù)酶與底物的結(jié)合模型分析，供體線性糊精與受體麥芽糖間的結(jié)合位點存在一定程度的重合。因此，在受體麥芽糖與亞位點+1、+2結(jié)合之前，供體中占據(jù)該亞位點的部分會在活性位點處開鏈以保證歧化反應(yīng)的進行（圖2A）[5]。耦合反應(yīng)本質(zhì)上是環(huán)化反應(yīng)的逆反應(yīng)，它遵循乒乓機制中的三元復(fù)合原則。通過來源于 Bacillus circulans（strain 251）的 CGTase與γ-CD的復(fù)合物晶體以及來源于Bacillus circulans（strain 8）的CGTase與β-CD的復(fù)合物晶體的X-衍射實驗，證明了環(huán)糊精與亞位點+2結(jié)合的氫鍵作用力小于相同條件下直鏈底物與該位點的氫鍵作用力，而且，環(huán)糊精結(jié)合至亞位點+2處時會擠占亞位點+1的空間，使得單糖受體無法結(jié)合到催化位點+1，只能通過三元復(fù)合的方式與CGTase以及環(huán)糊精相結(jié)合，等待環(huán)糊精解鏈完成后耦合至n個葡萄糖單元的直鏈糊精末端形成新的n+1個葡萄糖單元的直鏈糊精（圖2B）[10-11]。作為CGTase諸多功能中最為重要的部分，環(huán)化反應(yīng)必須由B，E兩個區(qū)域協(xié)同完成。如圖2C所示，E區(qū)域有兩個麥芽糖結(jié)合位點（MBS1，2），當(dāng)直鏈淀粉進入酶體系時，它首先與MBS1位點結(jié)合，后期通過延伸的方式到達(dá)MBS2位點，再經(jīng)由MBS2將其引導(dǎo)至B域的活性中心進行環(huán)化[12]。根據(jù)三元復(fù)合機制理論，由于反應(yīng)體系中活性位點附近其他的環(huán)狀或直鏈麥芽低聚糖會與待環(huán)化底物發(fā)生耦合，所以由MBS2位點輸送的直鏈淀粉底物不需要為環(huán)糊精成環(huán)預(yù)留出足夠的單元數(shù)。隨著反應(yīng)的進行，環(huán)糊精產(chǎn)物脫離酶的活性中心區(qū)域，底物淀粉鏈后續(xù)延伸至活性位點參與重復(fù)反應(yīng)，再者，未參與反應(yīng)的直鏈淀粉底物可以隨機取代與MBS1位點結(jié)合的已反應(yīng)淀粉鏈，維持環(huán)糊精產(chǎn)物的不斷生成[5]。

2 環(huán)糊精制備過程中的影響因素

環(huán)糊精工業(yè)生產(chǎn)流程大致可分為原料預(yù)處理、環(huán)糊精合成以及混合產(chǎn)物的分離純化3個步驟，影響這3個步驟中任一環(huán)節(jié)的影響因素都將影響環(huán)糊精產(chǎn)物的特異性及環(huán)糊精得率。流程簡圖見圖3。

圖3 環(huán)糊精生產(chǎn)流程簡圖Fig.3 Flow diagram of CD

2.1 反應(yīng)底物

在相同的反應(yīng)條件下，不同來源底物制備環(huán)糊精的得率及產(chǎn)物特異性不盡相同。Prado等人報道指出，來自B.clausii E16的CGTase作用麥芽糊精的主要產(chǎn)物是α-CD、β-CD、γ-CD 3種環(huán)糊精的混合物，而作用可溶性淀粉時的主要產(chǎn)物為β-CD和γ-CD[13]。由于淀粉主要由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，兩者均可作為反應(yīng)底物，但是，由于直鏈淀粉更容易和脂質(zhì)形成不易被酶作用的復(fù)合物，且支鏈淀粉與直鏈淀粉相比具有更多的還原性末端且具有緩慢回生的特性，以支鏈淀粉為底物時環(huán)糊精的得率高于以直鏈淀粉為底物時的得率[14]。玉米淀粉和小麥淀粉中的脂質(zhì)含量及小分子糖含量較高，不是理想的反應(yīng)底物；蠟質(zhì)玉米淀粉中支鏈淀粉含量高達(dá)100%，是比較理想的反應(yīng)底物，但價格較貴，亦不常使用；木薯淀粉和馬鈴薯淀粉常作為工業(yè)用反應(yīng)底物[15]。但在研究過程中，該結(jié)論尚存在爭議。例如曹新志等探索研究了來自B.alcalophilus的CGTase作用玉米淀粉、木薯淀粉、馬鈴薯淀粉、蕉藕淀粉和甘薯淀粉等對γ-CD的影響，發(fā)現(xiàn)以蕉藕淀粉和木薯淀粉為底物時，γ-CD的產(chǎn)量最高[16]；另有報道表明，來自B.alcalophilus NK231的CGTase作用玉米淀粉的轉(zhuǎn)化率高于馬鈴薯淀粉和甘薯淀粉[17]。Goh等人在報道中指出，底物類型-緩沖溶液組合對于環(huán)糊精的生產(chǎn)具有重要作用，他們采用經(jīng)基因突變的CGTase分別作用不同緩沖溶液體系的木薯淀粉、馬鈴薯淀粉、可溶性淀粉、玉米淀粉、直鏈淀粉、糖原等，最終發(fā)現(xiàn)在醋酸緩沖體系中的木薯淀粉轉(zhuǎn)化環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率最高，且產(chǎn)生γ-CD的比率最高[18]。

底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對環(huán)糊精的生成也有較大影響。通常，在低底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)上升趨勢，然而由于淀粉本身具有低溶解度、高粘度等特性，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)超過10%時，容易造成反應(yīng)過程中攪拌困難、反應(yīng)不均勻等導(dǎo)致環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率下降，因此，對淀粉底物進行預(yù)處理也將影響最終環(huán)糊精的得率。最初，研究者采用淀粉酶對淀粉進行部分降解，以增加其底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，減小底物粘度。CGTase發(fā)生環(huán)化反應(yīng)的最小作用底物是聚合度為8的低聚麥芽糖，僅以低相對分子質(zhì)量的麥芽低聚糖為底物時環(huán)糊精的得率很小，例如，以來自B.megaterium的CGTase催化葡萄糖和麥芽糖底物時，僅能產(chǎn)生質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%～2.0%的環(huán)糊精。Pishtiyski報道了DE值小于10時環(huán)糊精的得率，見表1。由表1可以看出，隨著DE值的升高，環(huán)糊精的得率明顯下降[14]。

表1 淀粉預(yù)處理對環(huán)糊精得率的影響[14]Table 1 Effect of starch treatment with α-amylase on CD production

環(huán)糊精得率除了受底物的濃度影響及小分子糖的影響外，還受淀粉底物分子中直鏈淀粉及支鏈淀粉比例的影響。曹新志等采用普魯蘭酶處理淀粉底物后，發(fā)現(xiàn)γ-CD的產(chǎn)量增加了5.3%，β-CD的產(chǎn)量增加了10.5%，但進一步增加普魯蘭酶的使用量時，β-CD及γ-CD的產(chǎn)量均有所下降。Goh的報道也支撐這一結(jié)論[18]，然而，Pishtiyski and Zhekova[14]，Szejtli[19]和 Saha and Zeikus[20]等將普魯蘭酶與CGTase同時作用淀粉時，并未發(fā)現(xiàn)對γ-CD的產(chǎn)量有增加效果。這些爭議的報道結(jié)論表明普魯蘭酶用于提高環(huán)糊精產(chǎn)量時，普魯蘭酶的用量是關(guān)鍵。

為實現(xiàn)對淀粉進行預(yù)處理，降低淀粉粘度的同時不減少環(huán)糊精的得率，研究者又發(fā)現(xiàn)，直接采用CGTase在高溫狀態(tài)下對淀粉進行預(yù)處理，隨后降低溫度使其進行催化反應(yīng)，可以降低淀粉底物的粘度，增加環(huán)糊精的得率[20-21]，該方法目前在工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。此外，采用擠壓、研磨、超聲等物理手段對淀粉進行預(yù)處理，亦可增加環(huán)糊精的得率[22-24]，但工業(yè)化應(yīng)用程度不高。淀粉底物的預(yù)處理過程中，糊化是關(guān)鍵。Kim等人篩選到了耐高溫的CG Tase（來自 Thermoanaerobacter sp.），分別以未經(jīng)任何預(yù)處理的玉米淀粉及適度熱處理的玉米淀粉為底物，控制反應(yīng)溫度為65℃，使淀粉在反應(yīng)過程中邊糊化邊參與反應(yīng)，簡化了環(huán)糊精的制備過程[25-26]。然而，對于常規(guī)的CGTase來說，淀粉原料的糊化程度直接影響環(huán)糊精的得率。

2.2 反應(yīng)條件

由于不同菌株產(chǎn)生的CGTase的酶學(xué)性質(zhì)不同，其最適pH、最適溫度、pH穩(wěn)定范圍、溫度穩(wěn)定范圍等各有差異，且反應(yīng)時間也會影響環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量[27]，工業(yè)生產(chǎn)過程中，對于固定來源的菌株，通常固定反應(yīng)條件，反應(yīng)時間也控制在30 h以內(nèi)。然而在反應(yīng)過程中的溫度波動，對環(huán)糊精的產(chǎn)量也將產(chǎn)生極大地影響。通常CGTase的反應(yīng)溫度在55～70℃之間，耐熱酶類的反應(yīng)溫度可以高達(dá)85℃（見表 2）[28-30]。

2.3 有機溶劑

環(huán)糊精制備過程中，由于水解、耦合、歧化等作用的存在，能夠形成系列小分子低聚糖，這些糖的存在，對環(huán)糊精的得率產(chǎn)生了極大的影響。前人研究中多采用添加環(huán)己烷、甲苯、乙醇、丙醇、丙酮等有機溶劑復(fù)合劑的辦法來提高環(huán)糊精的得率。但是添加極性有機溶劑與添加非極性有機溶劑對環(huán)糊精得率提高的機理不盡相同。Blackwood等人報道添加極性有機溶劑，不僅可以增加環(huán)糊精的得率，而且可以增加CGTase的選擇性[31]（表3），王亮等人的報道與此相符，但尚未有對該現(xiàn)象進行明晰解釋的機理[32，33]。具推測，反應(yīng)體系中生成的環(huán)糊精易和CGTase中E區(qū)的第二個麥芽糖鍵合區(qū)域MBS2（Tyr633）發(fā)生鍵合，而MBS2專門負(fù)責(zé)將淀粉分子鏈送往CGTase中A區(qū)的催化活性位點，環(huán)糊精的鍵合作用將阻止反應(yīng)的進一步進行。加入有機溶劑，一方面可以使有機溶劑與環(huán)糊精形成包合物，從而改變環(huán)糊精的構(gòu)象，從而脫離MBS2的鍵合位點；另一方面，可能改變酶分子表面及活性中心水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、淀粉分子表面水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)等，從而改變反應(yīng)平衡；也有推斷認(rèn)為，有機溶劑作為催化劑可以直接參與到催化反應(yīng)過程。在工業(yè)上，可以通過選擇有機溶劑的類型，來提高環(huán)糊精產(chǎn)品的選擇性。

表2 不同來源CGTase的最適反應(yīng)條件下產(chǎn)物比例Table 2 Ratio variation of serious CD under optimum reaction condition of different CGTase resource

工業(yè)上，制備α-CD常用的復(fù)合劑是正癸醇，制備β-CD常用的復(fù)合劑是環(huán)己烷，制備γ-CD常用的復(fù)合劑是十二元環(huán)以上的有機溶劑，如環(huán)十四碳-7-烯-1-酮和環(huán)十六碳-8-烯-1-酮等。

3 環(huán)糊精制備工藝改進

傳統(tǒng)的環(huán)糊精制備工藝多采用有機溶劑法制備，大致的操作工藝為將淀粉經(jīng)初步液化后加入反應(yīng)酶液，同時加入有機溶劑進行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，高溫蒸餾去除有機溶劑，低溫結(jié)晶制備得到環(huán)糊精，再經(jīng)進一步純化精制得到純的環(huán)糊精。但在實際生產(chǎn)中，有機溶劑往往具有毒性，不僅對環(huán)境造成污染，而且容易引起安全隱患，并且限制了所制備得到環(huán)糊精的應(yīng)用范圍。替代有機溶劑的膜分離、超濾、反滲透、色譜分離等方法顯示出了巨大的優(yōu)勢。目前關(guān)于膜分離及超濾裝置的使用，主要有兩種方法，一種是將膜分離/超濾裝置用于環(huán)糊精的制備過程中，使得膜分離起到及時分離去除反應(yīng)過程中的環(huán)糊精及小分子物質(zhì)，持續(xù)反應(yīng)平衡向生成環(huán)糊精的方向進行，同時起到固定化CGTase的作用，從而達(dá)到CGTase循環(huán)使用，并且能夠幫助實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)。Sakinah等人將膜的分離和酶的反應(yīng)過程結(jié)合起來，制成酶膜反應(yīng)器（EMR），用于環(huán)糊精制備過程，未轉(zhuǎn)化的淀粉及酶液可以被膜截留，而經(jīng)反應(yīng)轉(zhuǎn)化的環(huán)糊精可以滲透通過薄膜，由此可實現(xiàn)環(huán)糊精連續(xù)化生產(chǎn)[34-35]。他們設(shè)計的制備環(huán)糊精流程圖見圖4。

圖4 環(huán)糊精制備酶膜反應(yīng)器示意圖Fig.4 SEM diagram for CDs preparation

另一種方法是將膜分離/超濾裝置與反滲透裝置結(jié)合起來，用于后期環(huán)糊精的收集及分離。

Slominska等人設(shè)計的超濾連續(xù)化制備環(huán)糊精的過程圖見圖5[36]。

圖5 超濾反應(yīng)器示意圖Fig.5 Schematic diagram of UF reactor system

膜分離在工業(yè)化應(yīng)用過程中，膜分離效率受到溶液中成分的嚴(yán)重影響。例如淀粉底物的預(yù)處理程度、反應(yīng)溫度等影響體系粘度的反應(yīng)條件，需要嚴(yán)苛控制，否則反應(yīng)體系中高粘度不溶物的堆積容易堵塞膜的濾孔，造成越來越高的跨膜壓力，使得環(huán)糊精的產(chǎn)率下降。

4 環(huán)糊精的分離純化

環(huán)糊精制備過程中，利用β-CD溶解度小的特性，采用高溫溶解、低溫結(jié)晶的手段，可以使得β-CD得到純化，純度達(dá)到99%以上。然而，對于有機溶劑法制備得到的β-CD來說，環(huán)糊精的疏水空腔對有機溶劑具有很強的吸附力，盡管制備過程采用了有機溶劑脫除的處理技術(shù)，但由于環(huán)糊精空腔的疏水作用，使得最終有機溶劑存在部分殘留，導(dǎo)致環(huán)糊精的空腔無法完全釋放，最終將降低環(huán)糊精的溶解特性及包埋特性。關(guān)于此方面的研究報道較少，但涉及工業(yè)生產(chǎn)過程中環(huán)糊精品質(zhì)，是目前造成國內(nèi)外環(huán)糊精品質(zhì)差異的主要原因之一。在此方面加強研究，對于國內(nèi)環(huán)糊精的生產(chǎn)將具有非常重要的指導(dǎo)意義。

對于相對高水溶性的α-CD及γ-CD來說，工業(yè)化過程中常采用膜分離/過濾及柱色譜的方法[14]。工業(yè)色譜技術(shù)的發(fā)展促進了附加值更高的α-CD及γ-CD的生產(chǎn)。日本環(huán)糊精工業(yè)生產(chǎn)中，將硬脂酸鍵合到殼聚糖上制成的親和柱色譜，用于特異性分離α-CD[37]。離子交換色譜也常用于工業(yè)化α-CD及γ-CD的分離制備[38-40]。工業(yè)生產(chǎn)中，為得到純度較高的單一環(huán)糊精，通常將膜分離技術(shù)和色譜技術(shù)聯(lián)合使用，具有很好的分離效果，但同時也增加了成本，目前γ-CD的價格是β-CD價格的100倍左右，極大地限制了其在工業(yè)中大批量的使用。因此，探索快速、高效、便捷的環(huán)糊精分離技術(shù)，將是環(huán)糊精工業(yè)一直努力的方向。

如上所述，環(huán)糊精制備過程中，分離純化技術(shù)在一定程度上增加了環(huán)糊精的生產(chǎn)成本，然而在環(huán)糊精的某些應(yīng)用領(lǐng)域中（如食品），由于客體分子的復(fù)雜性導(dǎo)致單一環(huán)糊精主體存在局限性，不同比例環(huán)糊精混合物從而顯出絕對優(yōu)勢。目前國內(nèi)尚無此類產(chǎn)品生產(chǎn)，而日本已經(jīng)有大量的環(huán)糊精混合物用于食品、藥品及化妝品等方面。

5 展望

環(huán)糊精的制備過程，是一個復(fù)雜的生物轉(zhuǎn)化過程，轉(zhuǎn)化過程中涉及到的底物、酶、環(huán)境、反應(yīng)條件、工藝流程等因素的變化，都將最終影響到環(huán)糊精的得率及產(chǎn)物專一性。從酶作用淀粉底物的作用機理入手，分析導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)率及專一性變化的內(nèi)在原因，著眼影響反應(yīng)條件的因素進行研究，進而調(diào)整工藝路線及工藝步驟，不僅能夠更加深入地探索CGTase作用淀粉產(chǎn)生環(huán)糊精的作用模式，掌握其作用規(guī)律，而且將為環(huán)糊精工業(yè)的蓬勃發(fā)展提供強有力的參考。

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