李 峰， 張 敏， 鄒艷敏， 李 芳，朱伯樂， 趙 婷， 吳向陽， 仰榴青*

（1.江蘇大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3.江蘇大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

水飛薊（Sliybum maruianum （L.）Gaertn.）又名水飛雉、乳雉子，一至兩年生草本植物[1-2]。其有效成分水飛薊素具有清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化、抗肝纖維化、抗腫瘤和降血脂等生理活性[3]。近年來，隨著水飛薊素需求量的增加，水飛薊粕殘?jiān)搽S之增多。水飛薊粕主要由蛋白質(zhì)、粗纖維、多酚和黃酮類化合物等組成[4]，其中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22%～25%[5]。但目前一般作為廢物丟棄，既浪費(fèi)資源，又污染環(huán)境。如水飛薊粕直接作為動(dòng)物飼料使用，存在消化性和適口性差的問題。因此，作者采用霉菌和酵母菌組成的混菌劑對水飛薊粕進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，并優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成，以期得到蛋白質(zhì)含量高、適口性好的生物蛋白飼料，為水飛薊粕的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

水飛薊粕：江蘇中興藥業(yè)有限公司；麩皮、玉米粉：市售 （所有原料粉碎后過40目篩）；黑曲霉40226（Aspergillus niger）和熱帶假絲酵母 1254（Candida tropicalis）：中國工業(yè)微生物菌種保藏中心提供；斜面培養(yǎng)基：黑曲霉：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；熱帶假絲酵母：麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基；液體種子培養(yǎng)基：黑曲霉：沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基；熱帶假絲酵母：麥芽汁培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 將菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)72 h，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 液體種子培養(yǎng) 用接種環(huán)從真菌斜面取孢子一環(huán)，接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，120 r/min、28℃震蕩培養(yǎng)48 h。

1.2.3 固態(tài)發(fā)酵 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基混合均勻，接種培養(yǎng)基干重10%的黑曲霉和熱帶假絲酵母混菌劑，調(diào)節(jié)含水量為60%，28℃培養(yǎng)72 h，45℃烘干，測定粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3 單因素試驗(yàn)[6]

1.3.1 物料組成對混菌固態(tài)發(fā)酵的影響 以粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，分別考察了不同物料組成對混菌固態(tài)發(fā)酵的影響。其中水飛薊粕∶麩皮∶玉米粉（質(zhì)量比）分別選取 5∶3∶2、6∶3∶1、7∶2∶1、8∶1.5∶0.5、9∶0.5∶0.5 5 個(gè)水平。

1.3.2 碳源及其添加量對固態(tài)發(fā)酵的影響 在固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同碳源，考察碳源對固態(tài)發(fā)酵的影響。其中，碳源分別為葡萄糖、蔗糖和麥芽糖，添加量均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0%、0.5%、1%、2%、3%。

1.3.3 無機(jī)氮源及其添加量對固態(tài)發(fā)酵的影響在固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同氮源，考察氮源對固態(tài)發(fā)酵的影響。其中，氮源分別為尿素、硝酸銨和硫酸銨，添加量均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0%、1%、1.5%、2%、2.5%。

1.3.4 無機(jī)鹽及其添加量對固態(tài)發(fā)酵的影響 在固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同無機(jī)鹽，考察無機(jī)鹽對固態(tài)發(fā)酵的影響。其中，無機(jī)鹽為磷酸二氫鉀、氯化鈣和硫酸鎂，添加量均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%。

1.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果和Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，選取葡萄糖、尿素和磷酸二氫鉀3個(gè)對粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響較大的因素為自變量，以發(fā)酵后產(chǎn)品粗蛋白含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，對固態(tài)發(fā)酵營養(yǎng)因子進(jìn)行優(yōu)化；并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，每次設(shè)3個(gè)平行。試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Coded levels and factors of response surface analysis

1.5 分析方法

粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定：粗蛋白質(zhì)測定采用半微量凱氏定氮法，參照國標(biāo)GB/T 6432-94飼料中粗蛋白質(zhì)測定方法，用于比較發(fā)酵前后的蛋白質(zhì)氮量；粗蛋白質(zhì)體外消化率測定：粗蛋白質(zhì)體外消化率測定參照王衛(wèi)國等[8]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 物料組成 由圖1可知，當(dāng)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中含水飛薊粕比例為80%時(shí)，蛋白質(zhì)提高量相對較高，水飛薊粕所占比例少發(fā)酵基質(zhì)粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)低，隨著發(fā)酵基質(zhì)中水飛薊粕比例的升高，發(fā)酵樣品粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，但超過90%后反而下降，這可能是由于水飛薊粕含量過多，培養(yǎng)基過于黏稠，不利于溶氧和傳質(zhì)，影響菌體生長和產(chǎn)酶，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)品粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。最終選定固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中基礎(chǔ)物料水飛薊粕：麩皮：玉米粉（質(zhì)量比）為 8∶1.5∶0.5。

圖1 不同原輔料配比對粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.1 Effects of different ratio of raw and auxiliary materials on crude protein content

2.1.2 碳源及其添加量對固態(tài)發(fā)酵的影響 碳源是微生物的重要營養(yǎng)物質(zhì)，其主要作用是構(gòu)成微生物細(xì)胞的碳架和供給微生物生長繁殖所需的能源。由圖2可知，3種碳源對水飛薊粕粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有提高，其中葡萄糖為碳源時(shí)，粗蛋白質(zhì)提高量高于蔗糖和麥芽糖，且葡萄糖添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)品粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高最多。最終選擇葡萄糖作為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的外加碳源。

2.1.3 無機(jī)氮源及其添加量對固態(tài)發(fā)酵的影響由圖3可知，3種氮源對水飛薊粕粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有提高，其中，尿素為氮源時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)品粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高程度優(yōu)于硝酸銨和硫酸銨，且尿素添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)品粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高最大。再增加尿素含量，粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有減少，這是因?yàn)槟蛩貫榉堑鞍椎?，相對分子質(zhì)量較小，溶液滲透壓較高，含量過高時(shí)抑制菌體生長，影響粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加。最終選擇尿素作為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的外加氮源。

圖2 不同碳源對粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 Effects of different carbon resources on crude protein content

圖3 不同氮源對粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.3 Effects of different nitrogen resources on crude protein content

2.1.4 無機(jī)鹽及其添加量對固態(tài)發(fā)酵的影響 無機(jī)鹽是微生物生長繁殖必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，是發(fā)酵過程中的生長刺激因子，對菌體的生長具有重要意義。由圖4可知，3種無機(jī)鹽對發(fā)酵產(chǎn)品粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有所提高，其中磷酸二氫鉀的促進(jìn)作用最明顯，且添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%時(shí)，粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大。最終選擇磷酸二氫鉀作為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的外加無機(jī)鹽。

2.2 響應(yīng)面分析

根據(jù)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)有17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為析因點(diǎn)，5個(gè)為零點(diǎn)以估計(jì)誤差。試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表2。

圖4 不同無機(jī)鹽對粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.4 Effects of different inorganic salt resources on crude protein content

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface analysis

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，利用Design Expert 7.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)（表2）進(jìn)行回歸擬合，得到多項(xiàng)式響應(yīng)面回歸模型：

對所得模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，總模型P＜0.000 1，表明該模型高度顯著，失擬項(xiàng)不顯著（P=0.595 6＞0.05），表明模型選擇正確。相關(guān)系數(shù)R2=0.984 1，表明預(yù)測值與實(shí)測值之間具有較好的相關(guān)性，校正相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.963 6，說明響應(yīng)面96.36%的變化可以由此模型解釋，擬合程度較好，實(shí)驗(yàn)誤差小，可用來分析和預(yù)測固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基最佳營養(yǎng)因子水平。而且，由表3中所測系數(shù)及對應(yīng)的P值表明，方程的一次項(xiàng)顯著，其中X1、X2項(xiàng)極顯著；二次項(xiàng)極顯著，其中X12、X22項(xiàng)極顯著，X32項(xiàng)顯著；交互項(xiàng)中除X1和X2交互作用不顯著外，其他交互項(xiàng)的影響也是顯著的，說明因素之間的交互作用很明顯，因此可以用此回歸方程代替各組試驗(yàn)對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance for the response surface quadratic model

利用Design Expert7.0軟件對回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析得到各響應(yīng)面3D分析圖，見圖5。從圖5可以看出，各因素對提高水飛薊粕粗蛋白含量的影響順序?yàn)椋浩咸烟牵╔1）＞尿素（X2）＞磷酸二氫鉀（X3），其中磷酸二氫鉀對試驗(yàn)影響不顯著。通過對模型的擬合分析以及單因素試驗(yàn)結(jié)果，預(yù)測出最佳培養(yǎng)基組成為：水飛薊粕∶麩皮∶玉米粉（質(zhì)量比）為 8∶1.5∶0.5，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.11%葡萄糖、1.40%尿素和0.56%磷酸二氫鉀。響應(yīng)面模型在此條件下預(yù)測的發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為38.70%。

圖5 葡萄糖（X1）、尿素（X2）和磷酸二氫鉀（X3）對粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響的響應(yīng)面分析圖Fig.5 Response surface plot for the effects of glucose（X1），urea （X2）and potassium dihydrogen phosphate（X3）on crude protein content

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳培養(yǎng)基條件，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得發(fā)酵后水飛薊粕粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為38.43%，與理論預(yù)測值相差0.27%，說明該模型能較好地預(yù)測發(fā)酵情況。

2.4 體外消化率測定

樣品中蛋白質(zhì)的體外消化率采用胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步消化法測定，發(fā)酵后水飛薊粕粗蛋白體外消化率為88.92%，較未發(fā)酵水飛薊粕粗蛋白體外消化率（70.12%）有顯著提高，說明水飛薊粕蛋白質(zhì)在發(fā)酵過程中被水解為小分子蛋白或多肽，甚至氨基酸，更易被消化吸收，因而營養(yǎng)價(jià)值得到提高。顧賽紅等[9]利用黑曲霉PES固態(tài)發(fā)酵使棉籽粕粗蛋白體外消化率提高13.11%。該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，混菌固態(tài)發(fā)酵能夠明顯的提高水飛薊粕蛋白質(zhì)的體外消化率。

3 結(jié)語

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組成：水飛薊粕∶麩皮∶玉米粉（質(zhì)量比）為 8∶1.5∶0.5，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1.11%葡萄糖、1.4%尿素和0.56%磷酸二氫鉀，發(fā)酵水飛薊粕粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和體外消化率分別可達(dá)38.43%和88.92%。該工藝穩(wěn)定可行，為水飛薊粕固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料提供了一定的理論依據(jù)。

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