滕飛翔 吳雋松

Mg2+是活細(xì)胞中含量最豐富的二價陽離子之一，是多種酶的輔助因子，還是維持大分子有活性的構(gòu)象，脂類和磷酸肌醇類第二信使的調(diào)控，多種離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體的調(diào)控所必需的［1～11］。有研究表明Mg2+入胞會通過 Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)體等來實現(xiàn)，目前至少有七種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn) Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)體被發(fā)現(xiàn)［12～14］。MagT1是一種特異性的Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)體，可能在Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起重要作用。臨床觀察表明，心肌細(xì)胞內(nèi)游離Mg2+濃度過低時會導(dǎo)致心律失常等現(xiàn)象［15］。本研究試圖確定效果好的小干擾RNA(siRNA)，為深入使用RNA干擾方法研究MagT1在大鼠心肌細(xì)胞中的功能，最終治療相關(guān)心臟疾病奠定基礎(chǔ)。

1.材料和方法

1.1 材料 1天SD大鼠購于南通大學(xué)實驗動物中心;逆轉(zhuǎn)錄和RT－PCR試劑盒購自大連寶生物公司;MagT1 siRNA購于上海吉瑪公司;siRNA轉(zhuǎn)染試劑購自Invirgen公司;α－actin蛋白一抗和熒光二抗購自美國abcam公司。

1.2 實驗方法和步驟

1.2.1 大鼠心肌細(xì)胞的體外分離和siRNA轉(zhuǎn)染:選擇10只出生1天的SD大鼠乳鼠，在超凈臺里取出心臟，剪下心尖部分，減碎置于小瓶中，加入胰酶和Ⅰ型膠原酶混合物在37℃環(huán)境中震蕩消化，反復(fù)幾次，將分離下來的心肌細(xì)胞收集起來，鋪在培養(yǎng)皿中，24小時后鑒定心肌細(xì)胞純度。將4對siRNA和轉(zhuǎn)染試劑按照說明書中的比例混合起來，加入心肌細(xì)胞培養(yǎng)皿中，60小時后進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。

siRNA2 5'－GCGACGAAGUAAUAUGGAATT－3';5'－UUCCAUAUUACUUCGUCGCTT－3'siRNA3 5'－GGCAAGGAACGACUUAUAATT－3';5'－UUAUAAGUCGUUCCUUGCCTT－3'siRNA4 5'－GAUUGGACUUGUUGUGUUATT－3';5'－UAACACAACAAGUCCAAUCTT－3'

1.2.2 總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及RT－PCR反應(yīng):將Trizol加入轉(zhuǎn)染過MagT1 siRNA的心肌細(xì)胞培養(yǎng)皿中，隨后按照Trizol說明書上的步驟提取細(xì)胞總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄，然后使用PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測siRNA的下調(diào)效果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 PCR實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果以±s(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤)表示，組間比較用t檢驗。檢驗結(jié)果P＜0.05有顯著差異。

2.結(jié)果

2.1 大鼠心肌細(xì)胞鑒定 本研究選擇一種心肌細(xì)胞特有的α－actin蛋白的一抗［16］進(jìn)行免疫熒光反應(yīng)，散發(fā)綠色熒光的細(xì)胞是心肌細(xì)胞(見圖1A)。選取10個不同視野，每個視野點數(shù)200個細(xì)胞。2000個細(xì)胞中被染色的細(xì)胞有1932個，即心肌細(xì)胞純度為1932/2000×100%=96.6%。

圖1 大鼠心肌細(xì)胞中α－actin蛋白和細(xì)胞核的定位(40×)

2.2 RT－PCR反應(yīng)檢測siRNA沉默效果 向大鼠心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染4對siRNA 60小時后，通過RT－PCR實驗檢測siRNA對MagT1沉默效果。結(jié)果顯示(圖2)，siRNA1、siRNA2、siRNA3灰度值分別為0.85±0.03(P＞0.05)，0.65±0.04(P＞0.05)，0.73±0.04(P＞0.05)。siRNA4的灰度值是 0.13±0.03(P＜0.01)，沉默效果最好，因此選擇siRNA4進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖2 4對siRNA沉默效果的鑒定

3.討論

Mg2+是哺乳動物細(xì)胞中含量最豐富的二價陽離子之一，細(xì)胞核、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)Mg2+聚集和儲存的主要部位。Mg2+參與細(xì)胞內(nèi)多種生命活動，它是多種酶的輔助因子，可以參與維持大分子有活性的構(gòu)象，脂類和磷酸肌醇類第二信使的調(diào)控，電荷補(bǔ)償?shù)壬砘顒?。另外Mg2+可以調(diào)節(jié)平滑肌的松弛、冠狀動脈和末梢血管的膨脹、發(fā)揮抗心律失常藥的效果，因此心血管系統(tǒng)的健康與Mg2+有關(guān)［17～20］。

MagT1是一種特異性Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)體，對于Mg2+通透性最大，因此有可能是Mg2+進(jìn)入心肌細(xì)胞內(nèi)部的重要途徑之一。為了用RNA干擾方法研究心肌細(xì)胞中MagT1的功能，首先要確定沉默效果好的siRNA。本研究體外分離了心肌細(xì)胞，并設(shè)計、合成了4對siRNA，隨后使用RT－PCR方法從4對siRNA中篩選出了沉默效果最好的1對，序列為5'－GAUUGGACUUGUUGUGUUATT－3';5'－UAACACAACAAGUCCAAUCTT－3'，從而為深入研究MagT1在心肌中的功能奠定了一定的基礎(chǔ)。

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