李樹(shù)玲，顏 慧，宮澤輝

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所新藥評(píng)價(jià)研究室，北京 100850;2.北京軍區(qū)總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)科，北京 100700)

近年來(lái)，精神分裂癥的易感基因的鑒定及其功能研究大大推進(jìn)了對(duì)精神分裂癥病理機(jī)制的理解。神經(jīng)調(diào)節(jié)素1(neuregulin 1，Nrg1)及其受體ErbB4的編碼基因均是精神分裂癥的易感基因[1－2]。Nrg1是一類含表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)結(jié)構(gòu)域的營(yíng)養(yǎng)因子家族的一員，通過(guò)激活ErbB酪氨酸激酶發(fā)揮作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者腦內(nèi)Nrg1/ErbB4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)[3]。發(fā)育過(guò)程中，Nrg1/ErbB4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在γ－氨基丁酸能中間神經(jīng)元興奮性突觸及投射細(xì)胞抑制性突觸的形成中發(fā)揮作用[4－5]。Nrg1和 ErbB4也表達(dá)于成年腦中，通過(guò)促進(jìn)γ－氨基丁酸釋放來(lái)控制錐體神經(jīng)元放電和抑制長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)[6－8]。另外，ErbB4也高表達(dá)于多巴胺能神經(jīng)元中[9－10]。Nrg1和ErbB4等位基因或條件敲除鼠表現(xiàn)出活動(dòng)過(guò)度、潛伏抑制受損和工作記憶缺陷等精神分裂樣癥狀[7，11]。

盡管近年對(duì)Nrg1和ErbB4受體功能的研究進(jìn)展令人振奮，但該信號(hào)系統(tǒng)的許多關(guān)鍵性問(wèn)題依然不清楚，甚至有部分研究得出了相互矛盾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。研究Nrg1或ErbB4突變小鼠中Nrg1對(duì)神經(jīng)傳遞的影響表明，Nrg1/ErbB4信號(hào)通路的改變可能導(dǎo)致已經(jīng)異常發(fā)育的成熟大腦突觸可塑性調(diào)節(jié)紊亂。在空間和時(shí)間上控制Nrg1/ErbB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以分離發(fā)育和發(fā)育后機(jī)制建立的動(dòng)物模型將推動(dòng)未來(lái)的研究[1]。

為尋求ErbB4特異性調(diào)控手段，前期實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建了含綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標(biāo)簽的大鼠ErbB4基因特異性miRNA質(zhì)粒，對(duì)靶基因表達(dá)的抑制率可達(dá)70%以上[12]。為實(shí)現(xiàn)在活體神經(jīng)元中的持續(xù)調(diào)控，將前期實(shí)驗(yàn)所獲得的miRNA干擾序列構(gòu)建入慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，并包裝濃縮獲得高滴度慢病毒濃縮液，將所得慢病毒濃縮液經(jīng)立體定位微量注射感染小鼠海馬齒狀回，并在感染6個(gè)月后觀察基因表達(dá)情況，為后續(xù)ErbB4功能研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞

基于 pcDNA6.2－GW/EmGFP－miR(Invitrogen公司，美國(guó))的含有ErbB4基因特異性miRNA序列的pMir32質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。供體質(zhì)粒pDONR221，目的載體 pLenti6.3/V5－DEST，大腸桿菌菌株Stbl3和人胚腎細(xì)胞 HEK293T(Invitrogen公司，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器

BALB/c成年小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):SCXK－[軍]2007－004。

內(nèi)切酶EagⅠ(NEB公司，美國(guó));BP clonaseⅡ、LR clonaseⅡ、蛋白酶K、慢病毒包裝系統(tǒng)(含pLP1，pLP2和pLP/VSVG質(zhì)粒等)、脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Invitrogen公司，美國(guó));聚凝胺(Sigma公司，美國(guó));組織包埋劑Tissue－Tek? OCT(Sakura公司，美國(guó));小鼠抗神經(jīng)元核(neuronal nuclei，NeuN)抗原單克隆抗體;小鼠抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)單克隆抗體(Santa Cruz公司，美國(guó));紅色熒光素Tritc標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

雙臂小動(dòng)物腦立體定位儀(Stoelting公司，美國(guó));超微注射泵(WPI公司，美國(guó));CM1850型冷凍切片機(jī)(Leica公司，德國(guó));EVOS fl數(shù)碼熒光顯微鏡(AMG公司，美國(guó));LSM 510激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss公司，德國(guó))。

1.3 慢病毒載體構(gòu)建

用Gateway重組技術(shù)以篩選出的干擾質(zhì)粒pMir32構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體，步驟如下。將pMir32質(zhì)粒進(jìn)行EagⅠ酶切后，加入pDONR221質(zhì)粒和BP clonaseⅡ酶，室溫孵育過(guò)夜，以行BP重組，產(chǎn)生入門克隆。取其產(chǎn)物加入 pLenti6.3/V5－DEST質(zhì)粒和LR clonaseⅡ酶，25℃反應(yīng)5 h，以行LR重組，產(chǎn)生表達(dá)克隆。重組反應(yīng)液加入蛋白酶K，37℃反應(yīng)10 min后取 5 μl重組反應(yīng)液轉(zhuǎn)化 100 μl的stbl3感受態(tài)細(xì)胞，氨芐西林抗性篩選，測(cè)序驗(yàn)證質(zhì)粒插入片段是否正確，搖菌擴(kuò)增質(zhì)粒。

1.4 慢病毒包裝

取狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK 293T細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于100 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過(guò)夜，以第2天轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞均勻且融合度90%左右為最佳。取慢病毒表達(dá)質(zhì)粒和慢病毒包裝系統(tǒng)以1∶3的比例混合用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000按照說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。孵育6 h后，更換為含10%胎牛血清完全培養(yǎng)液 DMEM;轉(zhuǎn)染換液24和48 h后，分別收集培養(yǎng)上清。將收集到的病毒原液混合均勻后，4℃，3000 ×g 離心 30 min，上清用0.45 μm的濾器過(guò)濾得慢病毒原液后50000×g，4℃超速離心2 h，沉淀溶解在含有2%胎牛血清的DMEM中，分裝，－80℃保存，并留樣進(jìn)行滴度測(cè)定。

1.5 慢病毒活性滴度測(cè)定

實(shí)驗(yàn)第1天選取狀態(tài)良好的HEK293T細(xì)胞以每孔8×106個(gè)細(xì)胞接種6孔板。第2天慢病毒濃縮液用培養(yǎng)基以10倍倍比稀釋后，分別感染HEK293T細(xì)胞，并加入聚凝胺 8 mg·L－1，孵育過(guò)夜。同時(shí)消化空白對(duì)照孔，細(xì)胞計(jì)數(shù)。第3天細(xì)胞換液，繼續(xù)培養(yǎng)。慢病毒感染細(xì)胞72 h后，在熒光顯微鏡下觀察各孔細(xì)胞GFP表達(dá)情況。收集細(xì)胞PBS洗1次后，用1%的多聚甲醛固定細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP表達(dá)陽(yáng)性比例。以GFP表達(dá)率在1%～30%間的稀釋孔按下列公式計(jì)算病毒滴度[13]:病毒滴度=病毒感染時(shí)細(xì)胞數(shù)量×GFP表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞比例×病毒稀釋倍數(shù)/接種體積。

1.6 慢病毒對(duì)活體小鼠海馬齒狀回的感染及轉(zhuǎn)導(dǎo)情況觀察[14]

BALB/c成年小鼠ip給予水合氯醛150 mg·kg－1和烏拉坦1125 mg·kg－1麻醉，固定于立體定位儀上。以橫縱坐標(biāo)定位前囟，進(jìn)而參照小鼠腦立體定位圖譜確定齒狀回的位置:前囟后2.0 mm，前囟側(cè)1.6 mm，顱骨面下2.6 mm。以超微注射泵控制以0.2 μ·lmin－1的速度在每側(cè)注射1 μl慢病毒濃縮液并留針5 min。BALB/c小鼠在慢病毒注射6個(gè)月后，ip給予戊巴比妥鈉60 mg·kg－1麻醉，心臟灌流后取腦，4%多聚甲醛固定24 h，30%蔗糖沉底，以40 μm厚度行冠狀面冰凍切片。熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況。

1.7 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞類型檢測(cè)

腦片以0.2%Triton，5%BSA封閉1 h后，分別以小鼠抗NeuN抗體(1∶100)和小鼠抗GFAP抗體(1∶50)4℃孵育過(guò)夜;Tritc標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(1∶100)室溫孵育2 h后，以 DAPI(1∶5000)染核10 min，封片，激光共聚焦顯微鏡觀察、掃描成像。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建的慢病毒載體

含有ErbB4基因特異性miRNA序列的pMir32質(zhì)粒經(jīng)Gateway重組后所得克隆測(cè)序顯示質(zhì)粒插入片段與設(shè)計(jì)一致(圖1)，提示片段正確插入，目的慢病毒載體 pLenti6/V5－GW/EmGFP－ErbB4－miR構(gòu)建成功。

Fig.1 Sequence of lentivirus vector pLenti6/V5－GW/EmGFP－ErbB4－miR.

2.2 慢病毒在HEK293T細(xì)胞中的包裝

將以上慢病毒表達(dá)質(zhì)粒和慢病毒包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察到報(bào)告基因GFP的顯著表達(dá)(圖2)。收集培養(yǎng)上清，過(guò)濾并濃縮培養(yǎng)上清，得慢病毒濃縮液。

Fig.2 Fluorescent observation of lentivirus packaging in HEK293T cells 24 h after transfection.The green fluorescent protein(GFP)expression showing the successfully lentivirus packaging.

2.3 慢病毒活性滴度

空白對(duì)照孔HEK293T細(xì)胞計(jì)數(shù)為1.826×106個(gè)細(xì)胞。10倍梯度稀釋的慢病毒濃縮液各取20 μl分別感染HEK293T細(xì)胞72 h后，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)顯示100倍稀釋孔中GFP的表達(dá)率為10.68%(圖3)，計(jì)算得病毒活性滴度為1.0×1012轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(transduction units，TU)·L－1。

Fig.3 Titer of lentivirus stock 72 h post－transduction in HEK293T cells determined with flow cytometry.A:mock－transduced cells;B:10 －2－fold lentivirus stock－transduced cells.

2.4 慢病毒在活體小鼠腦組織的表達(dá)

由圖4所示，小鼠在海馬齒狀回定位注射慢病毒濃縮液1.0×1012TU·L－16個(gè)月后，腦冰凍切片熒光觀察顯示，外源基因主要在注射部位即海馬齒狀回表達(dá)，細(xì)胞胞體及其投射的神經(jīng)纖維均被GFP標(biāo)記，提示慢病毒對(duì)所注射部位的長(zhǎng)期穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)。

Fig.4 Expression of lentivirus on hippocampus dentate gyrus in mice 6 months after transduction with lentivirus 1.0 × 1012transduction unit·L－1.Green fluorescence showing the expression of lentivirus.

2.5 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞類型

免疫熒光染色顯示，慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞即GFP陽(yáng)性細(xì)胞多呈NeuN抗體標(biāo)記陽(yáng)性，并與GFAP的表達(dá)不重疊，提示慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞類型主要為神經(jīng)元(圖5)。有一部分顆粒細(xì)胞下層區(qū)域的GFP陽(yáng)性細(xì)胞沒(méi)有與NeuN共標(biāo)記，由于慢病毒可以感染非分裂細(xì)胞和分裂細(xì)胞，推測(cè)這一部分GFP陽(yáng)性細(xì)胞可能是神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞。

3 討論

Fig.5 Primary cell type transduced by lentivirus is neurons.Confocalimmunofluorescence microscopy images of hippocampal dentate gyrus sections from lentivirus－injected mice.GFP as a reporter was used to track lentivirus mediated expression(A1 and A2).Immunofluorescence stainings with antibodies specific for neuronal marker neuronal nuclei(NeuN)(B1)and astrocytesmarkerglialfibrillary acidic protein (B2)were performed.Nuclei were stained by DAPI(C1 and C2).Merged imagewasalsoshown(D1andD2).Arrowspointto colocalization of GFP fluorescence with NeuN(D1).

Nrg1/ErbB4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和可塑性，在精神分裂癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1－2，4－5]。為尋求 ErbB4 特異性調(diào)控手段，前期實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了大鼠ErbB4基因特異性miRNA質(zhì)粒，獲得了理想的干擾效率。通過(guò)RNAi成功地抑制目的基因的表達(dá)不僅需要高效特異性地靶向目標(biāo)基因的干擾序列，還需要合適的基因傳遞方法。傳遞的方法因細(xì)胞種類和實(shí)驗(yàn)要求不同而異。為實(shí)現(xiàn)在體神經(jīng)元的長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，本研究采用了慢病毒載體系統(tǒng)。慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，既可感染分裂細(xì)胞，也可用于感染依靠傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞如原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞和處于非分裂狀態(tài)的細(xì)胞，并且在感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，復(fù)制缺陷型載體的使用使被轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞不產(chǎn)生觸發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)的病毒蛋白，作為哺乳動(dòng)物體內(nèi)基因傳遞的手段非常適用于長(zhǎng)期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究[15]。并且慢病毒還可用于基因敲除、基因治療和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究。

本研究在慢病毒微注射6個(gè)月后仍觀察到了與miRNA同順?lè)醋颖磉_(dá)的GFP的表達(dá)，表明慢病毒介導(dǎo)的有效基因傳遞和長(zhǎng)期外源基因表達(dá)，說(shuō)明慢病毒可以作為體內(nèi)長(zhǎng)效實(shí)驗(yàn)的工具。本研究構(gòu)建的ErbB4基因miRNA慢病毒載體及慢病毒包裝所得高滴度慢病毒濃縮液為ErbB4的長(zhǎng)期功能研究提供了手段。

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