喻 晶，張繼青，葛 寧，刁 波，張 宜，陳福慈，呂 玲，羅遠(yuǎn)菊，劉 宏

(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院1.藥劑科，3.腫瘤放療科，4.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科，湖北武漢 430070;2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢 430065)

隨著核能在國民經(jīng)濟(jì)和軍事領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用，各種輻射事故和災(zāi)難導(dǎo)致的放射性物質(zhì)泄漏時有發(fā)生。人體在短時間內(nèi)暴露于大劑量射線輻照環(huán)境中，會誘導(dǎo)產(chǎn)生具有強(qiáng)氧化活性的自由基，使細(xì)胞膜、DNA和蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生脂質(zhì)過氧化[1－3]，引起直接受照組織和細(xì)胞的輻射損傷。因此，從防護(hù)的角度減少或淬滅輻射誘導(dǎo)的自由基，終止或抑制其對生物組織和細(xì)胞產(chǎn)生的氧化性損傷一直是輻射防護(hù)研究的核心問題之一[4]。槲皮素(quercetin)是一種天然黃酮類化合物，廣泛存在于蔬菜、水果和茶葉中[5]，具有顯著的抗氧化和清除自由基的作用[6－7]。本研究從細(xì)胞水平探討槲皮素對大劑量輻射所致PC12細(xì)胞氧化性損傷的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制，以期為黃酮類化合物在神經(jīng)系統(tǒng)輻射防護(hù)方面的研究和利用積累資料。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

槲皮素(批號:QU20101102，純度98.7%)購自鄭州荔諾生物科技有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司;胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自NQBB公司;胰蛋白酶購自Amresco公司;噻唑藍(lán)(MTT)購自Biosharp公司;二甲亞砜(DMSO)購自Sigma公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和總抗氧化能力(total antioxidative capacity，T－AOC)測試試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。Precise e1293醫(yī)用直線加速器，瑞典ELECTA公司;RT－6500酶標(biāo)分析儀，中國深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司;2120 UV紫外分光光度計(jì)，韓國QPTIZEN公司;F－4500熒光分光光度計(jì)，日本 Hitachi公司;CK2－TR倒置顯微鏡，日本Olympus公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物配制

PC12細(xì)胞為神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)分化型，由本院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科保存。細(xì)胞用含10%FBS，青霉素100 kU·L－1和鏈霉素100 mg·L－1的 DMEM 高糖培養(yǎng)液，以1.0×108L－1密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將槲皮素溶于DMSO，配成100 mmol·L－1儲備液，－20℃保存，使用時用DMEM高糖全培養(yǎng)液稀釋至實(shí)驗(yàn)濃度。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖反應(yīng)

將PC12細(xì)胞以1.0×108L－1的密度接種到96 孔板，每孔100 μl，待細(xì)胞90%融合后，加入槲皮素 6.25，12.5，25，50 和 100 μmol·L－1分別作用24，48和72 h，吸棄原培養(yǎng)液，PBS洗2次，每孔加入濃度為 5 g·L－1MTT 20 μl，于 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄各孔MTT加入DMSO 100 μl，充分振搖培養(yǎng)板，用酶標(biāo)儀測定波長492 nm處吸光度(A)值。每組設(shè)6復(fù)孔。

PC12 細(xì)胞與槲皮素 12.5，25 和 50 μmol·L－1預(yù)作用2 h后接受照射。本課題組采用從1～9 Gy多個輻射劑量進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PC12細(xì)胞在經(jīng)4 Gy X線輻照24 h后細(xì)胞周期出現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯，故本研究在此基礎(chǔ)上選取4 Gy X線，從輻照所致PC12細(xì)胞氧化性損傷的角度探討槲皮素的輻射防護(hù)效果。照射條件:采用6 MeV X線，照射劑量為4 Gy，劑量率為2 Gy·min－1，皮靶距為60 cm，照射野為20 cm×20 cm。同時設(shè)正常對照組和輻射對照組。每組設(shè)6復(fù)孔。各組于照射后24 h用上述MTT法檢測細(xì)胞增殖反應(yīng)。

1.4 細(xì)胞SOD活性、MDA和ROS含量及T－AOC檢測

將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行消化、計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×108L－1，接種到5個培養(yǎng)瓶中，每瓶5 ml，待細(xì)胞90%融合后，隨機(jī)分成正常對照組、輻射對照組(4 Gy)、輻射 +槲皮素 12.5，25 和50 μmol·L－1組。PC12 細(xì)胞與槲皮素預(yù)作用 2 h 后再接受照射。照射條件同上。各組均于照射后24 h收集細(xì)胞，－80℃保存，備用。細(xì)胞常溫裂解30 min后，混勻，取混懸液，用黃嘌呤氧化酶法檢測細(xì)胞SOD活性，硫代巴比妥法檢測MDA含量，菲啉絡(luò)合法檢測T－AOC，DCFH－DA探針法檢測ROS含量，嚴(yán)格按照檢測試劑盒說明書操作。ROS含量用熒光強(qiáng)度表示。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對PC12細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響

與正常對照組比較，槲皮素在作用24 h(r=0.887，P＜0.01)和 48 h(r=0.872，P＜0.01)，PC12細(xì)胞增殖反應(yīng)隨槲皮素濃度的增加而增高;作用72 h，槲皮素對PC12細(xì)胞增殖反應(yīng)具有明顯的抑制作用，并隨槲皮素濃度的增加抑制作用增強(qiáng)(r=0.942，P＜0.01)(表1)。

Tab.1 Effect of quercetin on PC12 cell proliferation in vitro

2.2 槲皮素對輻射損傷PC12細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響

由表2可以看出，與正常對照組比較，PC12細(xì)胞受輻射后細(xì)胞增殖反應(yīng)明顯降低(P＜0.01)。與輻照對照組比較，槲皮素12.5，25 和 50 μmol·L－1防護(hù)組PC12細(xì)胞增殖反應(yīng)明顯增強(qiáng)(P＜0.05，P＜0.01)，且具有濃度效應(yīng)關(guān)系(r=0.751，P＜0.01)。

Tab.2 Effect of quercetin on proliferation of PC12 cells injured by X－ray in vitro

2.3 槲皮素對輻射損傷PC12細(xì)胞SOD活性、MDA含量、T－AOC和ROS的影響

由表3可以看出，與正常對照組比較，PC12細(xì)胞受輻射后SOD活性和T－AOC降低(P＜0.01)，MDA和ROS含量增加(P＜0.01)。與輻照對照組比較，槲皮素 12.5，25 和 50 μmol·L－1防護(hù)組PC12細(xì)胞 SOD 活性(r=0.837，P＜0.01)和T－AOC(r=0.940，P＜0.01)隨槲皮素濃度增高而增高，MDA 含量(r=0.845，P＜0.01)和 ROS 含量(r=0.930，P＜0.01)隨槲皮素濃度的增高而降低，表明槲皮素對PC12細(xì)胞的輻射防護(hù)作用具有濃度效應(yīng)關(guān)系。

Tab.3 Effect of quercetin on superoxide dismutase(SOD)，malonedialdehyde(MDA)，total anti－oxidation capacity(TAOC)and reactive oxygen species(ROS)of PC12 cells injured by X－ray in vitro

3 討論

據(jù)報道，槲皮素能減輕γ射線照射誘導(dǎo)的人外周血淋巴細(xì)胞的 DNA 損傷，其濃度在24 μmol·L－1時防護(hù)效果最佳[8]。槲皮素濃度＜100 μmol·L－1時對人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的氧化性損傷具有保護(hù)作用，但濃度＞100 μmol·L－1時作用 24 h 后出現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性[9]。本研究結(jié)果表明，槲皮素≤100 μmo·lL－1時作用24和48 h對PC12細(xì)胞具有促增殖作用，槲皮素≥12.5 μmol·L－1時作用72 h抑制細(xì)胞增殖，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。由此可見，槲皮素對細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響具有雙向性，且呈濃度依賴關(guān)系，與文獻(xiàn)報道一致[10]。此作用機(jī)制可能是因外界刺激后導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)液中過氧化物的蓄積所致[11]。

電離輻射作為一種高能物理損傷因素，可通過電離激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生大量自由基，當(dāng)自由基產(chǎn)生過多而不能及時地清除時就會引起一系列的輻射損傷[12－13]，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量可反映細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，SOD活性則反映細(xì)胞清除自由基的能力，兩者間接體現(xiàn)出輻照后細(xì)胞內(nèi)氧化損傷體系的強(qiáng)弱。本研究結(jié)果表明，X線輻射PC12細(xì)胞后胞內(nèi)ROS增加、發(fā)生脂質(zhì)過氧化、SOD 活性和T－AOC下降。槲皮素 12.5，25 和50 μmol·L－1均表現(xiàn)出明顯的抗輻射效果，其抗輻射作用與槲皮素濃度呈良好的相關(guān)性。據(jù)報道，Na+/K+/2Cl－協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能參與調(diào)控槲皮素對PC12細(xì)胞的生長分化[14]，其是否也參與槲皮素對輻射所致PC12細(xì)胞氧化性損傷的防護(hù)機(jī)制的調(diào)控有待研究。

本研究僅從槲皮素對輻射所致PC12細(xì)胞氧化性損傷的角度說明其具有一定的輻射防護(hù)作用，但這種神經(jīng)保護(hù)作用可能還與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期和調(diào)節(jié)胞內(nèi)信號等作用機(jī)制有關(guān)，故槲皮素輻射生物學(xué)作用的機(jī)制還有待更深層次的研究。此外，槲皮素是否能應(yīng)用于臨床放療前或放療中對非靶點(diǎn)組織的輻射防護(hù)，還需要更多的細(xì)胞學(xué)、實(shí)驗(yàn)動物學(xué)甚至臨床實(shí)驗(yàn)等來驗(yàn)證。

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