賈晨曦，郭曉華，b，劉廣純，b

（沈陽大學(xué)a.生命科學(xué)與工程學(xué)院，b.遼寧省城市有害生物治理與生態(tài)安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110044）

核酸序列攜帶生物起源、進(jìn)化、種群多樣性等重要信息［1］.核酸序列研究的重要前提是提取基因組DNA.金龜子是鞘翅目中較大的類群之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值.植食性種類多是農(nóng)作物、林木、果樹的重要害蟲；糞食性或腐食性種類有清除糞便等保護(hù)環(huán)境作用.由于標(biāo)本采集受季節(jié)、地域等因素限制，用活體或新鮮標(biāo)本作為試材較為困難，標(biāo)本保存方式十分重要［2］.DNA 成功提取也受提取方法的直接影響［3］4869.有關(guān)昆蟲標(biāo)本保存和基因組DNA 提取方法的研究曾有過報(bào)道［4］，但金龜子相關(guān)研究報(bào)道十分有限.探討金龜子標(biāo)本的最佳保存方式和DNA 提取方法，對(duì)于研究金龜類昆蟲的分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，尤其對(duì)昆蟲分類新型技術(shù)——DNA 條形碼的研究具有重要意義［5］.

1 材料與方法

1.1 材 料

以金龜科Scarabaeidae星花金龜屬Potosia的白星花金龜Potosia（L.）brevitarsis（Lewis）作為實(shí)驗(yàn)材料.

樣本于2010—2012年采自吉林、遼寧等地，捕捉法采集.

1.2 方 法

1.2.1 標(biāo)本保存

（1）乙醇浸制標(biāo)本.將采集的金龜子預(yù)先饑餓24h以上，使其消化道內(nèi)物質(zhì)消化完全（防止外源DNA 對(duì)目的DNA的干擾），分別浸入無水乙醇及75%乙醇中，12h 置換1 次乙醇，更換3次后于4℃冰箱保存，制成浸制標(biāo)本.

（2）干制標(biāo)本.將樣本饑餓24h后，用昆蟲針插于標(biāo)本盒中，置于通風(fēng)處自然陰干制成干制標(biāo)本.

1.2.2 基因組DNA 提取

采用SDS蛋白酶K 法、CTAB法、飽和NaCl法3種方法提取DNA.用無菌水清洗金龜子標(biāo)本胸部3～5次，并用濾紙吸干.

（1）SDS 蛋白酶K 法.①取蟲體胸部肌肉0.1～0.2g，放入2.0ml EP管中，加入500μL勻漿液（0.1 mol／L EDTA，pH＝8.0；0.1 mol／L NaCl；0.05 mol／L Tris－HCl，pH＝7.6；10%SDS；2mg／mL 蛋白酶K）和少許滅菌的細(xì)石英砂，用玻璃棒研磨充分.②將研磨好的混合液置于55℃金屬浴中消化12h 左右.③加入500μL Tris－平衡酚，上下顛倒充分混勻，置4 ℃離心機(jī)中，8 000r／min離心10min.取上清液至另一支EP管，重復(fù)此步驟一次.④加入與上清液等體積Cl液（V（氯仿）∶V（異戊醇）＝24∶1），上下顛倒充分混勻，置離心機(jī)中4℃，10 000r／min離心10 min，取上清液至EP 管中.⑤在上清液中加入2倍體積的無水乙醇，放入－20 ℃冰箱內(nèi)靜置30 min，使DNA 沉淀，置離心機(jī)中12 000r／min離心5min，棄去乙醇.⑥加入－20℃保存的70%乙醇400μL，對(duì)沉淀物進(jìn)行洗滌，12 000r／min離心5min，棄去乙醇，待完全干燥后加入50μL 1×TE緩沖液，置于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆?

（2）CTAB法.參照Boyce的方法［6］.①取蟲體胸部肌肉置于2.0mL EP 管中研磨.②加入2×CTAB提取緩沖液（0.1mol／LTris－HCl，1.4 mol／L NaCl，0.02mol／L EDTA，0.2%β－巰基乙醇，0.05mol／L CTAB，pH＝8.3）混勻，于65℃金屬浴中消化1h 以上.③11 000r／min離心15 min，取上清液至另一支EP 管.④加入等體積Cl液，11 000r／min離心10min.取上清液，反復(fù)抽提3次.⑤加入等體積異丙醇，－20℃沉淀過夜.⑥棄去異丙醇，加400μL 70%乙醇洗滌DNA，自然干燥后加100μL TE 緩沖液溶解，置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?β－巰基乙醇和CTAB為美國Amresco公司生產(chǎn).

（3）飽和NaCl法.參照張建珍的DNA 提取方法并略有改進(jìn)［7］.①取蟲體胸部肌肉于2.0mL EP管中研磨.②加入400μL 勻漿液（STE，pH＝8.0；1%SDS；200μg／mL 蛋白酶K），置于65℃金屬浴中消化12h 以上.③加入300μL 飽和NaCl，渦旋45s后于離心機(jī)中10 000r／min離心30min，取上清液至另一支EP 管.④加入等體積異丙醇－20 ℃沉淀過夜.⑤棄去液體，向沉淀DNA 管中加50μL TE緩沖液，置于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.2.3 基因組DNA的電泳檢測

取5μL DNA 樣品及3μL的上樣緩沖液（6×loading buffer），在0.8%的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳緩沖液為1×TAE，Genefinder染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，保存結(jié)果.

1.2.4 PCR 擴(kuò)增及測序

用FF：5′－ttacacactccttagcggat－3′和DD：5′－gggacccgtccttgaaacac－3′雙 向 引 物［8］，PCR 擴(kuò) 增28SrDNA（D3－D6）核基因序列.50μL 反應(yīng)體系包含10×buffer 5μL，dNTP 5μL，Taq DNA 聚合酶0.3μL，上下游引物各1.0μL，模板3μL，無菌水34.7μL.反應(yīng)程序包括：94℃預(yù)變性4min，94℃變性30s、52℃退火30s、72℃延伸40s共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸4min.1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，拍照.將電泳條帶明亮、未經(jīng)純化的擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工有限公司進(jìn)行純化及雙向測序，測序儀為ABI－PRISM 3730.

1.2.5 序列拼接及多重同源比對(duì)

應(yīng)用DNAstar軟件中的Seqman 進(jìn)行自測序列正反鏈拼接，刪掉引物部分并在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 相似性搜索，以保證測得序列為目的基因.用Clustal X2.0 軟件將拼接序列與GenBank下載的花金龜屬Cetonia aurata aurata（序列號(hào)EU084146）序列進(jìn)行比對(duì)，保存為Nexus格式.

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA提取

應(yīng)用SDS－蛋白酶K 法、CTAB法、飽和NaCl法分別對(duì)3種不同保存方式的標(biāo)本進(jìn)行基因組DNA 提取，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，用3種提取方法提取不同保存方式標(biāo)本的DNA 時(shí)，其獲得率有一定差異.SDS－蛋白酶K 法提取無水乙醇保存標(biāo)本、75%乙醇保存標(biāo)本、干制標(biāo)本的DNA 電泳條帶清晰明亮（見圖1）；CTAB法也能提取一定量基因組DNA（見圖2）；飽和NaCl法提取無水乙醇保存的標(biāo)本DNA 獲得率較高（見圖3 中1～3），而75%乙醇保存的標(biāo)本DNA 獲得率較低（見圖3中6～8），干制標(biāo)本基本沒有提出DNA（見圖3中4～5）.

圖1 不同保存方式下SDS－蛋白酶K法提取DNA的電泳圖譜Fig.1 The gel electrophoresis pattern of genomic DNA extracted by SDS－protease K under different preservation methods

圖2 不同保存方式下CTAB法提取DNA的電泳圖譜Fig.2 The gel electrophoresis pattern of genomic DNA extracted by CTAB under different preservation methods

圖3 不同保存方法下飽和NaCl法提取DNA的電泳圖譜Fig.3 The gel electrophoresis pattern of genomic DNA extracted by Saturated NaCl under different preservation methods

2.2 28SrDNA基因序列的PCR擴(kuò)增

用不同保存方法和DNA 提取方法獲得的DNA 提取液作為模板，進(jìn)行28SrDNA 基因序列PCR 擴(kuò)增并電泳檢測，結(jié)果見圖4.其中用SDS－蛋白酶K 法提取3種方法保存標(biāo)本的DNA，均擴(kuò)增出28SrDNA 基因序列（1～5）；CTAB 法也可以從無水乙醇保存（6～7）、75%乙醇（8～9）、干制（10）的標(biāo)本中擴(kuò)增目的基因，但干制標(biāo)本擴(kuò)增目的基因的效果沒有達(dá)到100%（11）；用飽和NaCl法時(shí)，僅無水乙醇保存的1個(gè)標(biāo)本擴(kuò)增出目的基因（13），另一標(biāo)本的目的基因也未得到有效擴(kuò)增（12），75%乙醇和干制保存的標(biāo)本中則沒有擴(kuò)增出目的基因（14～15）.

將自測的白星花金龜28SrDNA 序列與GenBank中Cetonia aurata aurata 同源序列進(jìn)行BLAST 比較，結(jié)果顯示同源性高達(dá)到99%以上.應(yīng)用Clustal X 2.0軟件進(jìn)行多重比對(duì)的結(jié)果表明（見圖5），通過不同保存方法和DNA 提取方法獲得的DNA 模板所擴(kuò)增的10個(gè)片段（a～j），其核苷酸序列完全一致，說明只要擴(kuò)增出目的片段，其核苷酸序列正確并穩(wěn)定.由于GenBank數(shù)據(jù)庫中未見星花金龜屬和白星花金龜?shù)?8S rDNA 序列，故以花金龜屬代表種為對(duì)照，比對(duì)結(jié)果顯示白星花金龜與Cetonia aurata aurata 相差3個(gè)核苷酸位點(diǎn)，反映出種屬間的28SrDNA 序列差異.

圖4 不同保存方式和提取方法的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（28SD3－D6rDNA片段）的凝膠電泳圖譜Fig.4 The gel electrophoresis pattern of the PCR amplification products（28SD3－D6rDNA gene fragment）of the different preservation methods and extraction methods

3 討 論

圖5 不同保存方式和DNA提取方法下28SrDNA序列Clustal X 2.0多重比對(duì)（點(diǎn)代表與第一行堿基相同）Fig.5 Clustal X 2.0multiple alignment of the 28SrDNA sequences from specimens under the different preserved conditions and the different DNA－extracted methods（Identity with first sequence denoted by dots）

在許多情況下，長距離、大范圍的標(biāo)本采集后需要優(yōu)選正確的保存方式；獲得種類齊全，尤其是稀有種的標(biāo)本信息，也要選擇DNA 降解少的標(biāo)本保存方法.昆蟲標(biāo)本保存方法不同，組織DNA降解程度亦不同.P??bo等認(rèn)為，干制標(biāo)本早期受內(nèi)源酶水解而破壞，有效避免DNA 降解的關(guān)鍵是盡量縮短動(dòng)物死亡到完全干燥的時(shí)間.本研究采用捕捉方法采集標(biāo)本，經(jīng)1d饑餓處理，選用無水乙醇、75%乙醇、針插干制3種方法保存.采用SDS－蛋白酶K 法和CTAB 法提取DNA 時(shí)，3種保存方法基本可提取高質(zhì)量的DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測時(shí)，基因組DNA 和擴(kuò)增基因的電泳條帶整齊、明亮；飽和NaCl法提取DNA 時(shí)，經(jīng)無水乙醇保存的標(biāo)本，有時(shí)可有效提取DNA 并擴(kuò)增目的基因，而75%乙醇保存和干制標(biāo)本的基因擴(kuò)增不理想，有明顯降解，無PCR 擴(kuò)增條帶.譚亮魁等研究天?；蚪MDNA的提取方法及保存方式的結(jié)果表明，提取乙醇保存和干制標(biāo)本時(shí)，CTAB法和SDS－蛋白酶K 消化法均優(yōu)于飽和NaCl法，這與本研究結(jié)論相似［3］4870.張建珍用飽和NaCl法提取蝗蟲基因組DNA的結(jié)果表明，70%乙醇固定的標(biāo)本和部分干標(biāo)本提取的總DNA 得率較低，而100%乙醇浸泡標(biāo)本提取的總DNA 帶型整齊［7］.28SrDNA 是昆蟲研究應(yīng)用較多的DNA條形碼序列.擴(kuò)增目的片段的長度與DNA的降解程度關(guān)系密切.有學(xué)者對(duì)步甲的館藏50年以上干制標(biāo)本進(jìn)行DNA 提取和基因擴(kuò)增，獲得250～345bp長度的28SrDNA 基因片段.本研究PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜表明，11個(gè)標(biāo)本的PCR 擴(kuò)增片段長度均為750bp以上（見圖4），說明標(biāo)本沒有出現(xiàn)影響片段長度的降解現(xiàn)象.金龜類甲蟲鞘翅堅(jiān)硬，透水透氣性差，夏季高溫陰雨天氣易使蟲體霉變，組織完全陰干所需時(shí)間較長，因此，活體標(biāo)本盡快浸入乙醇是最佳的保存方法.CTAB法在提取過程中不需要蛋白酶K 等價(jià)格較昂貴的藥品試劑，并適于3種保存方式標(biāo)本的DNA提取.同時(shí)盡量選擇蟲體胸部和腿部肌肉組織，避免消化道食物影響DNA 提取結(jié)果.

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