李哲，劉衛(wèi)東，陳曦，賈士儒，吳洽慶，朱敦明，馬延和

1 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457

2 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 工業(yè)酶國家工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

光學(xué)純二芳香基甲醇是合成許多手性藥物的重要中間體，例如：(R)-nebenodine，(R)-orpheadrine和 (S)-carbinoxamine[1-2]。使用芳香基親核試劑對芳基醛進(jìn)行加成是合成二芳香基甲醇常用的方法[1]，但是芳香基親核試劑有許多缺點(diǎn)，如價(jià)格昂貴、不適合大規(guī)模應(yīng)用或產(chǎn)物的 ee值和收率較低等[3]。對前手性二芳香基甲酮進(jìn)行不對稱還原是獲得二芳香基甲醇最直接的方法。用化學(xué)合成的方法可以達(dá)到這種目的，但只對一些具有特殊結(jié)構(gòu)的底物，如苯環(huán)的鄰位有取代基或者羰基的一邊是芳香雜環(huán)時(shí)，產(chǎn)物的ee值才較高[4-5]，而對于羰基兩側(cè)的取代基差異性較小，如對位甲基取代的二苯基甲酮，則產(chǎn)物的光學(xué)純度非常低(ee＜26%)。

羰基還原酶具有高度的化學(xué)、區(qū)域和立體選擇性，常用于手性醇的合成，一些酶催化的反應(yīng)已經(jīng)被用于工業(yè)生產(chǎn)[6-8]。雖然利用分離純化的羰基還原酶催化二芳香基酮不對稱還原已有報(bào)道[3,9]，但因?yàn)樵擃惖孜锏奈蛔璐蟆Ⅳ驶鶅蓚?cè)的取代基差異性較小，常常使得反應(yīng)的活性和立體選擇性不能滿足醫(yī)藥工業(yè)的需求。因此，對二芳香基甲酮的不對稱還原仍是生物催化中很有挑戰(zhàn)性的難題之一，尋找具有較高反應(yīng)活性和立體選擇性的還原較大位阻二芳香基甲酮的羰基還原酶具有很好的理論和應(yīng)用價(jià)值。

豐富多樣的微生物為發(fā)現(xiàn)新的羰基還原酶提供了寶貴的資源，然而傳統(tǒng)的菌種篩選方法耗時(shí)、低效。近年來，基因組測序技術(shù)的發(fā)展使得可以通過基因數(shù)據(jù)分析快速發(fā)現(xiàn)新的目標(biāo)酶[10-11]。畢赤酵母 GS115基因組序列已被測定[12]，本文通過對畢赤酵母GS115的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的羰基還原酶，能夠不對稱還原二芳香基甲酮類化合物，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，為該酶的進(jìn)一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

畢赤酵母Pichia pastoris GS115為實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌Escherichia coli Rosseta2 (DE3)、DH5α、表達(dá)質(zhì)粒 pET32a (+)均購自 Novagen公司。

1.2 培養(yǎng)基、主要試劑及儀器

P. pastoris GS115采用YPD培養(yǎng)基在30 ℃進(jìn)行培養(yǎng)。大腸桿菌DH5α和Rosseta2 (DE3)在37 ℃用Luria-Bertani培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA和蛋白Marker購于Fermentas公司；高保真PCR擴(kuò)增試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購于北京賽百盛生物技術(shù)公司。二芳香基甲酮類化合物購于Sigma公司；二芳香基醇消旋體通過NaBH4還原制得；蛋白純化儀：?KTA purifier 10，所用層析柱均為GE公司，高效液相色譜儀為 Agilent 1206型；手性分離柱OD-H及AD-H柱均購于DAICEL公司。其他所用試劑均為分析純。

1.3 目的基因的克隆表達(dá)

P. pastoris GS115中目的基因pascr序列從EMBL數(shù)據(jù)庫獲得 (GenBank Accession No.XM_002492630.1)。根據(jù)所選擇的蛋白對應(yīng)的核酸序列設(shè)計(jì)引物，正向：5￠-CGCCATATG GTTTC TAAGGTTTTATTGACA-3￠，反向：5￠-CCGCTC GAGTTTATTAGCACGCAATATCT-3￠，下劃線部分分別為NdeⅠ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸15 min。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分離純化，核酸回收試劑盒回收目的片段，回收產(chǎn)物用NdeⅠ和 XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后用T4 DNA連接酶連接到用相同內(nèi)切酶切過的質(zhì)粒pET32a (+)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，挑取陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證。將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosseta2(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。

將成功轉(zhuǎn)化的單克隆接種于 10 mL含有終濃度100 μg/mL氨芐青霉素以及34 μg/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜，然后轉(zhuǎn)接到含有同樣抗生素的800 mL的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到OD600為1.0左右，向培養(yǎng)基中添加終濃度為0.1 mmol/L異丙基-β-D硫代半乳糖苷 (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)，37 ℃誘導(dǎo)4 h，于4 ℃、7 000×g離心15 min收集菌體。

1.4 目的蛋白的分離純化

收集菌體用生理鹽水洗滌 2次后重懸于100 mL預(yù)冷的緩沖液A中 (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，5%甘油，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑)，高壓勻漿破碎，20 000×g離心30 min，棄去細(xì)胞碎片。上清用0.22 μm濾膜過濾后上樣，上樣流速為 3 mL/min，用 B液 (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，5%甘油，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑)進(jìn)行0～250 mmol/L咪唑線性洗脫，收集不同組分。用SDS-PAGE以及活力測定檢驗(yàn)?zāi)康牡鞍姿诮M分，合并純度較高的樣，使用超濾管 (Millipore截留分子量為10 kDa)進(jìn)行超濾濃縮和脫鹽。蛋白質(zhì)濃度用BCA試劑盒進(jìn)行測定，使用牛血清白蛋白BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.5 酶的輔酶偏好性及分子量測定

羰基還原酶 PasCR的輔酶偏好性是以苯乙酮為底物使用96孔板在酶標(biāo)儀上進(jìn)行活力測定，反應(yīng)總體積為200 μL，體系中含有酶液、底物以及輔酶NADPH或NADH，通過連續(xù)監(jiān)測340 nm吸光度下輔酶的消耗 (ε=6 220 L/(mol·cm))進(jìn)行測定。每分鐘消耗1 μmol輔酶所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位。動(dòng)力學(xué)參數(shù)在最適pH下按上述方法分別以苯乙酮和 4-氯-3-羰基丁酸乙酯為底物測定。

羰基還原酶 PasCR在溶液中的聚集狀態(tài)通過結(jié)合凝膠層析以及SDS-PAGE來進(jìn)行確定。所用層析柱為Superdex 200 10/300 GL。流動(dòng)相為20 mmol/L磷酸緩沖液，150 mmol/L NaCl，pH 7.2，流速為0.4 mL/min。蛋白的分子量大小通過和標(biāo)準(zhǔn)蛋白的保留體積進(jìn)行計(jì)算得到。標(biāo)準(zhǔn)蛋白為：Ovalbumin (43.0 kDa)，Conalbumin (75.0 kDa)，Conalbumin (158.0 kDa)，F(xiàn)erritin (440.0 kDa)，Thyroglobulin (669.0 kDa)。

1.6 pH及溫度對酶活的影響

PasCR的最適反應(yīng)pH通過在不同pH的緩沖液中測定酶的活力確定。緩沖液分別為100 mmol/L的醋酸/醋酸鈉緩沖液 (pH 4.0～6.0)，100 mmol/L的磷酸鈉緩沖液 (pH 6.0～8.0)，100 mmol/L Tris-HCl緩沖液 (pH 8.0～9.0)。PasCR的最適反應(yīng)溫度通過以苯乙酮為底物在不同溫度下測定酶的活力確定。

pH穩(wěn)定性是將酶在不同pH的緩沖液中4 ℃孵育30 h，然后測定剩余活性，不同pH緩沖液如上所述。酶熱穩(wěn)定性是將純化后的酶放在含有100 mmol/L NaCl的Tris-HCl (20 mmol/L，pH 8.0)緩沖液中不同溫度下分別孵育不同時(shí)間，然后檢測殘余酶活力。

1.7 不同化學(xué)物質(zhì)對酶穩(wěn)定性的影響

在等量的酶液中分別加入金屬螯合劑EDTA、變性劑等不同化學(xué)物質(zhì)，室溫下孵育0.5 h后，測定其殘留活性，以不處理的酶液的活性作為對照。

1.8 酶對二芳香基甲酮類化合物的不對稱還原

葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)的輔酶再生體系用于催化反應(yīng)。1 mL磷酸鈉緩沖液 (100 mmol/L，pH 6.5)的反應(yīng)體系中包含：底物100 μL (母液100 mmol/L溶于甲醇)，葡萄糖18 mg，NADP+0.5 mg，葡萄糖脫氫酶2 mg，PasCR 2 mg，30 ℃、200 r/min搖床反應(yīng)。過夜反應(yīng)后，用相同體積的甲基叔丁基醚萃取，取出有機(jī)相層，除去溶劑后用HPLC流動(dòng)相溶解，HPLC檢測ee值及轉(zhuǎn)化率，產(chǎn)物的構(gòu)型通過和文獻(xiàn)比較確定[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 羰基還原酶PasCR序列比對及分析

基因pascr位于畢赤酵母GS115的3號(hào)染色體上，編號(hào)為 chr3_0449，其所編碼蛋白的標(biāo)注為“putative dihydrokaempferol 4-reductase”。Blast結(jié)果顯示 PasCR與短鏈脫氫酶家族的蛋白有較高的同源性。PasCR與小家鼠 Mus musculus delta-5-3-β-hydroxysteroid 脫氫酶 (3β-HSD Gene ID M58567)[13]、木蘭假絲酵母 Candida macedoniensis的羰基還原酶 (MER Gene ID AB183149)[14]、赭色擲孢酵母 Sporobolomyces salmonicolor AKU4429的羰基還原酶 (SSCR Gene ID AF160799)[15]、魯氏接合酵母Zygosaccharomyces rouxii的羰基還原酶(Zygosaccharomyces gene ID AF178079)[16]、釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae的羰基還原酶(YOL151w Gene ID Z74893)[17]分別有 25%、38%、31%、31%、43%的同源性，序列比對的結(jié)果如圖1所示。短鏈脫氫酶家族的蛋白主要有3個(gè)功能區(qū)：輔酶結(jié)合區(qū)、反應(yīng)催化區(qū)及底物結(jié)合區(qū)。從比對結(jié)果可以看出PasCR的N端非常保守，主要是結(jié)合輔酶，三聯(lián)催化基團(tuán) (Tyr174、Ser135、Lys178)這在短鏈脫氫酶家族中也是非常保守的；而C端同源性較低，主要決定了酶的底物譜及立體選擇性[18]。因此，與這些已知的短鏈脫氫酶家族中的酶相比，PasCR可能具有比較獨(dú)特的底物譜及立體選擇性。

2.2 羰基還原酶PasCR的構(gòu)建表達(dá)及純化

以畢赤酵母GS115基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增的基因片段 (1 065 bp)，經(jīng)測序驗(yàn)證和目的基因一致。成功構(gòu)建出工程菌pET32a(+)-pascr，并在大腸桿菌 Rosseta2 (DE3)中進(jìn)行了重組表達(dá)，蛋白的C端帶有6×His tag標(biāo)簽。經(jīng)Ni-NTA純化，得到了高純度的目的蛋白。蛋白表達(dá)及純化SDS-PAGE圖譜見圖2。PasCR單體的分子量為 39.2 kDa，凝膠層析結(jié)果顯示酶的分子量大約為80 kDa，說明其在溶液中以二聚體形式存在。

2.3 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定

圖1 羰基還原酶PasCR序列比對結(jié)果Fig. 1 Amino acid sequence alignment of PasCR from P. pastoris GS115 with Mus musculus delta-5-3-β-hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD), Candida macedoniensis carbonyl reductase (MER), Sporobolomyces salmonicolor AKU4429 carbonyl reductase (SSCR), Zygosaccharomyces rouxii carbonyl reductase(Zygosaccharomyces )and Saccharomyces cerevisiae carbonyl reductase (YOL151w).

圖2 PasCR蛋白純化SDS-PAGE圖譜Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the purified PasCR.1: molecular mass standard; 2: uninduced; 3: crude cell-free extract; 4: purified PasCR.

PasCR專一性地利用NADPH作為輔酶，在以NADH作為輔酶時(shí)對苯乙酮沒有表現(xiàn)出活力。PasCR在最適pH條件下對苯乙酮、4-氯-3-羰基丁酸乙酯和輔酶NADPH的動(dòng)力學(xué)參數(shù)列于表1。從表中可以看出羰基還原酶 PasCR對脂肪族的4-氯-3-羰基丁酸乙酯的親和力和催化效率都遠(yuǎn)高于芳香族的苯乙酮，因此 PasCR對 4-氯-3-羰基丁酸乙酯具有更高的催化活性。

2.4 酶的最適反應(yīng)pH、溫度及pH和熱穩(wěn)定性

以苯乙酮為底物，羰基還原酶 PasCR在pH 6.5的磷酸緩沖液中表現(xiàn)出了最高活性，結(jié)果如圖 3所示。在 pH 6.5的條件下羰基還原酶PasCR在35 ℃條件下表現(xiàn)出了最高活性，而到60 ℃時(shí)沒有任何活性 (圖 4)，可能在該溫度下PasCR已失活。

表1 PasCR對苯乙酮、4-氯-3-羰基丁酸乙酯和輔酶NADPH的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of PasCR for acetophenone, ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate and NADPH

圖3 酶的最適反應(yīng)pHFig. 3 Effect of pH on enzyme activity in different buffers, acetic acid/sodium acetate buffer (●), sodium phosphate buffer (■)and Tris-HCl buffer (▲). The maximum activity in pH 6.5 was taken as 100%.

圖4 酶的最適反應(yīng)溫度Fig. 4 Effect of temperature on enzyme activity. The optimal temperature of the carbonyl reductase PasCR was estimated at various temperatures (25 °C ? 60 °C)in phosphate buffer (100 mmol/L, pH 6.5).

pH穩(wěn)定性研究表明，在pH 4.5～9.0范圍內(nèi)PasCR有較好的穩(wěn)定性 (圖5)。熱穩(wěn)定研究表明，在30 ℃的條件下PasCR有很好的穩(wěn)定性，而在45 ℃和 50 ℃條件下 PasCR的穩(wěn)定性較差，在45 ℃時(shí)PasCR的半衰期約80 min，而在50 ℃的條件下PasCR的半衰期只有10 min (圖6)。

圖5 酶的pH穩(wěn)定性Fig. 5 Effect of pH on enzyme stability in different pH buffers, acetic acid/sodium acetate buffer (pH 4.5?6.0,●), sodium phosphate buffer (pH 6.0?8.0, ■)and Tris-HCl buffer (pH 8.0?9.0, ▲).

圖6 酶的溫度穩(wěn)定性Fig. 6 Effect of temperature on enzyme stability, the samples was withdrawn at different time intervals, the activity of enzyme without pre-incubation was taken as 100%.

2.5 化學(xué)物質(zhì)對酶的穩(wěn)定性影響

不同化學(xué)物質(zhì)對酶穩(wěn)定性影響分析結(jié)果見表2，從表中可以看出金屬螯合劑EDTA對酶的活力沒有明顯影響，說明該酶不需要金屬離子的輔助。β-巰基乙醇主要是破壞二硫鍵，對酶的活性也沒有明顯影響。一些非離子型表面活性劑如曲拉通X?100當(dāng)添加1%時(shí)PasCR酶活喪失了近一半，而SDS濃度為0.5%時(shí)直接使酶失活。四氫呋喃可以使酶的活性提高，但當(dāng)濃度大于10%時(shí)酶的活性明顯降低 (數(shù)據(jù)未顯示)。

表2 不同化學(xué)物質(zhì)對酶活的影響Table 2 Effect of different chemicals on PasCR activity

2.6 對二芳香基甲酮的不對稱還原

PasCR對二芳香基甲酮類化合物表現(xiàn)出了較好的活性，對它們進(jìn)行催化反應(yīng)的結(jié)果如表3所示。當(dāng)?shù)孜餅?-氟苯甲酮時(shí)，僅有5%的轉(zhuǎn)化率和2.7%的ee值，隨著對位取代基團(tuán)位阻的變大和供電子效應(yīng)的增強(qiáng)，氯取代和甲基取代的二苯甲酮的轉(zhuǎn)化率分別提高至40%和80%，ee值分別提高至 67%和 85%，并且產(chǎn)物構(gòu)型均由 R變成了 S。而鄰位取代基是甲基和氯時(shí)，產(chǎn)物的ee值分別為78%和80%，但是轉(zhuǎn)化率都較低。當(dāng)?shù)孜餅榉謩e為2-苯甲酰吡啶和3-苯甲酰吡啶時(shí)，與之前的文獻(xiàn)[3,9,19-21]報(bào)道不同的是，產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率達(dá)90%，但是ee值僅有22%和14%。當(dāng)?shù)孜餅?,2-二苯基乙酮時(shí)，產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率為88%，ee值達(dá)到了92%。說明PasCR對二苯基取代的一系列大位阻底物表現(xiàn)出了較好的轉(zhuǎn)化率和ee值。

表3 羰基還原酶PasCR對二芳香甲酮化合物的還原Table 3 Reduction of diary ketones by carbonyl reductase PasCR

3 結(jié)論

本文成功從畢赤酵母GS115中克隆出1個(gè)新的羰基還原酶基因，將其在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)純化，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，該酶以NADPH作為輔酶，能夠?qū)σ恍w積較大的二芳香基甲酮類物質(zhì)進(jìn)行不對稱還原，當(dāng)苯環(huán)上對位的取代基越大時(shí)產(chǎn)物的ee和轉(zhuǎn)化率越高。最適反應(yīng)pH為6.5，最適反應(yīng)溫度為35 ℃，在溶液中以二聚體形式存在。該酶在催化一些位阻較大的二芳香基甲酮類化合物，表現(xiàn)出與已經(jīng)報(bào)道的羰基還原酶不同的特性。文獻(xiàn)報(bào)道來源于赭色擲孢酵母Sporobolomyces salmonicolor的及一些商業(yè)來源的羰基還原酶對對位取代的二苯基甲酮表現(xiàn)出較低的立體選擇性，而還原苯甲酰基吡啶時(shí)，產(chǎn)物的ee值可達(dá)99%[3,9]。固定化的釀酒酵母細(xì)胞不對稱還原 2-苯甲?；拎ど傻拇糴e值能達(dá)到有96%[22]。與此相反，PasCR不對稱還原4-甲基二苯甲酮和4-氯二苯甲酮時(shí)，得到產(chǎn)物的ee較高，而對2-苯甲酰吡啶和3-苯甲酰吡啶表現(xiàn)出較低的立體選擇性。由于對位取代的二苯基甲酮的不對稱還原具有更大的挑戰(zhàn)性，來源于畢赤酵母的羰基還原酶 PasCR將具有很好的應(yīng)用價(jià)值和潛力。

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