高蔚豐，王娟

寧夏大學生命科學學院，寧夏 銀川 750021

胰高血糖素樣肽 1受體 (Glucogan-like peptide 1 receptor，GLP-1R)是 Drucher等于1987年在大鼠胰島瘤細胞RIN1046-38中發(fā)現(xiàn)，屬于G蛋白耦聯(lián)受體B家族中的胰高血糖素樣受體亞家族[1]。該亞家族最明顯的特征是具有相對較長的胞外N端序列，通過3對二硫鍵形成一個球狀結構域，該區(qū)域在配體結合過程中起著關鍵作用[1-2]。胰高血糖素樣肽 1受體 N端片段(nGLP-1R)中形成3對二硫鍵的6個半胱氨酸是高度保守的。Aruna Bazarsuren等發(fā)現(xiàn)，3對二硫鍵分別是由 C46與 C71、C62與 C104、以及 C85與C126形成[3]。還有文獻報道，nGLP-1R的6個色氨酸中，W72和 W110在 G蛋白耦聯(lián)受體家族中是高度保守的[4]，將 W39、W72、W91、W110、W120分別突變?yōu)楸彼?(A)后，這些突變體都失去了與GLP-1結合的能力。但相反的是，將受體上的 W87突變?yōu)楸彼岷螅撏蛔凅w具有和野生型相同的親和能力，其介導的信號轉導也很相似[5-6]。

腸促胰島素類似物 (Exendin-4)的結構與功能與胰高血糖素樣肽1 (Glucogan-like peptide 1,GLP-1)相似[7-12](與GLP-1有53%的氨基酸序列一致性)，都是通過其中心域和 C末端與GLP-1R上的N末端域之間的相互作用實現(xiàn)其與GLP-1R的結合[13-14]。GLP-1與胰島素分泌和糖代謝調節(jié)密切相關[15]，對 GLP-1R結構和信號傳導機制的研究有助于了解其在糖尿病病理進程中的作用，可望為糖尿病的治療提供新的方向[16-21]。目前，很多研究集中在配體[22-24]及受體片段與 GLP-1結合位點的研究[25]及受體胞內(nèi)跨膜結構的研究上[26]。Exendin-4與nGLP-1R的結合能力比GLP-1更強[13]，其結合位點存在差異?？紤]到對nGLP-1R與Exendin-4的結合位點的不可知性，采用易錯PCR (Error-prone PCR, epPCR)方法建立了一個鼠肺的不同長度nGLP-1R (從受體N端的第21個氨基酸開始到第145個氨基酸)的噬菌體隨機突變展示肽庫，然后利用Exendin-4篩選，以此來判斷是否某一段基因或兩段基因的缺失會影響到nGLP-1R與Exendin-4結合的活性。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株大腸桿菌E. coli XL1-Blue、輔助噬菌體VSCM13和噬菌粒 Pfuse5為西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室保存；質粒pET-28a(+)-GLP-1R為華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室自行構建；Exendin-4為華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室自行純化。pMD-18T載體試劑盒購自TaKaRa公司；小鼠抗 M13噬菌體酶聯(lián)單抗 Anti-M13-HRP monoclonal conjugate購自Amersham Pharmacia公司；限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶為 MBI公司產(chǎn)品；TMB顯色底物購自天根公司；胰化蛋白胨和酵母提取物購自OXOID公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進口的分析純。

1.2 構建 nGLP-1R的不同長度的易錯 PCR突變庫

考慮到對nGLP-1R與Exendin-4的結合位點的不可知性，我們在以前工作的基礎上[27]根據(jù)nGLP-1R的基因序列設計了 2對引物，primer 11f-SfiⅠ從基因序列的第30個堿基開始，primer 21f-SfiⅠ從基因序列的第60個堿基開始，primer 11r-SfiⅠ則是到基因序列的第345位截止，primer 21r-SfiⅠ則是到基因序列的第 315位截止 (引物序列如表1所示)。以此來判斷是否某一段基因或兩段基因的缺失會影響到nGLP-1R與Exendin-4結合的活性。以pET-28a(+)-GLP-1R為模板，用引物 primer 1f-SfiⅠ作為上游引物，primer 1r-SfiⅠ、primer 11r-SfiⅠ、primer 21r-SfiⅠ分別作為下游引物；primer 11f-SfiⅠ作為上游引物，primer 1r-SfiⅠ、primer 11r-SfiⅠ、primer 21r-SfiⅠ分別作為下游引物；primer 21f-SfiⅠ作為上游引物，primer 1r-SfiⅠ、primer 11r-SfiⅠ、primer 21r-SfiⅠ分別作為下游引物，通過兩輪易錯PCR擴增9段長度不同的片段。

表1 本研究中所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3 GLP-1受體N端片段噬菌體突變庫的擴增、富集和滴度測定

噬菌體的擴增、富集及滴度測定參考文獻[28]進行。以固定于 96孔板孔中的 50 μg/mL的Exendin-4對nGLP-1R的隨機突變庫進行了3輪親和篩選。

1.4 單克隆噬菌體的制備

從富集過程中用于計數(shù)的平板上隨機挑取20個單菌落，分別接種于10 mL SB (30 g/L 胰化蛋白胨，20 g/L 酵母提取物，10 g/L MOPS，40 μg/mL四環(huán)素，100 μg/mL氨芐青霉素，pH 7.0)中進行擴增，將擴增后的噬菌體滴度調至1.0×1012PFU/mL。

1.5 噬菌體的ELISA檢測

在 96孔板的每孔中加入 50 μL Exendin-4(50 μg/mL)，4 ℃包被過夜；清洗后，加入含脫脂奶粉的 TBST溶液 (50 mol/L Tris,150 mmol/L NaCl，40 g/L脫脂奶粉，pH 7.5)，37 ℃封閉1 h后雙蒸水洗5次；加入50 μL單克隆噬菌體上清 (1.0×1012PFU/mL)，37 ℃孵育2 h，充分洗滌；加入用含40 g/L脫脂奶粉的TBST按1∶1 000的比例稀釋的小鼠抗M13噬菌體酶聯(lián)單抗50 μL，37 ℃反應1 h，充分洗滌；TMB顯色15 min后，以2 mol/L H2SO4終止反應，測OD455值。

2 結果與分析

2.1 nGLP-1R的不同長度突變體庫的構建

通過兩輪易錯PCR擴增9段長度不同的片段 (圖 1)，構建 nGLP-1R隨機突變體庫，經(jīng)平板計數(shù)測得的庫容量約為 9.6×107。對隨機挑選的30個突變體的測序結果表明，11個產(chǎn)生了移碼突變，5個存在顛換 (AT-TA)，而每個突變體中至少有 2個堿基發(fā)生了突變，最多的則有 13個堿基產(chǎn)生了突變，這與文獻中報道的突變率大于2%的突變率范圍是相符合的[29]。

2.2 nGLP-1R突變庫的親和篩選

從對nGLP-1R的隨機突變庫的親和篩選結果(表2)看，第1輪篩選的產(chǎn)率大于(1.0×10?7)%，表明篩選過程中篩選方法、菌的生長狀態(tài)、感染過程或溶液均符合要求。隨著淘洗的進行，產(chǎn)率逐漸升高，說明具有特異性結合能力的噬菌體通過篩選得到了較好的富集。

2.3 nGLP-1R突變體結合Exendin-4活性的鑒定

圖1 九段長度不同的nGLP-1R片段的PCR擴增結果Fig. 1 PCR products of nine nGLP-1R gene segments with different length. M: DNA marker; 1: 345 bp; 2:315 bp; 3: 285 bp; 4: 315 bp; 5: 285 bp; 6: 255 bp; 7:375 bp; 8: 345 bp; 9: 315 bp.

表2 nGLP-1R噬菌體隨機突變肽庫的篩選Table 2 Enrichment of nGLP-1R phage randomly mutated library by biopanning

從生物富集時用于計數(shù)的平板上隨機挑選了30個單菌落，用ELISA法測定了噬菌體上清與Exendin-4的結合活性。結果顯示，大部分噬菌體都具有一定的與Exendin-4結合的活性。但其中有一株 EP16與野生型 nGLP-1R (wt nGLP-1R)相比沒有活性，通過測序發(fā)現(xiàn)，EP16長度為95個氨基酸，缺失了前面的20個和后面的10個氨基酸，并且第52位色氨酸突變?yōu)榱司彼帷榱烁玫卮_定EP16與Exendin-4無結合活性，使用引物primer 21f-SfiⅠ和primer 11r-SfiⅠ構建了野生型EP16 (wtEP16)，使用重疊PCR法構建第 52位色氨酸突變?yōu)榫彼岬娜LnGLP-1R (nGLP-1RW52R)，以質粒 pET-28a(+)-GLP-1R為模板，以primer 1f-SfiⅠ為上游引物，E52 reverse (5￠-catctggccagcaggcgtagtca-3￠)為下游引物擴增出 nGLP-1R的前半段基因序列；以引物 E52 forward (5￠-tgactacgcctgctggccagat-3￠)為上游引物，primer 1r-SfiⅠ為下游引物擴增出nGLP-1R的后半段基因序列；以這兩段基因序列為模板，primer 1f-SfiⅠ和 primer 1r-SfiⅠ為引物，通過重疊延伸PCR法，改變wtnGLP-1R中的第52位氨基酸序列。以輔助噬菌體VSCM13作為陰性對照，利用3次獨立的ELISA試驗對其結合活性進行驗證 (表3)。結果顯示，wtEP16結合 Exendin-4的活性與 wtnGLP-1R相當，nGLP-1RW52R沒有結合Exendin-4的活性。

2.4 EP16突變體氨基酸序列分析

對篩選得到的EP16突變體的氨基酸序列分析 (圖2)顯示，EP16中有1個氨基酸發(fā)生突變：第52位色氨酸 (W)突變?yōu)榫彼?(R)，且缺失了前20個和后10個氨基酸。

由于EP16既有缺失又有突變，所以在無法確定其活性的喪失是由于突變造成還是由于缺失部分氨基酸造成的情況下，構建了wtEP16及nGLP-1RW52R來進行對比。結果發(fā)現(xiàn) wtEP16是有結合 Exendin-4活性的，nGLP-1RW52R沒有結合Exendin-4的活性 (表3)。由此說明，突變體EP16無活性是由于其第52位色氨酸突變?yōu)榫彼岫鸬?。EP16失去結合Exendin-4的活性可能是由于以下原因：1)色氨酸是非極性氨基酸，在突變?yōu)闃O性帶正電的精氨酸后，可能會對nGLP-1R的整個肽鏈的極性產(chǎn)生影響，從而影響到受體的折疊構象使得受體與配體Exendin-4間的交聯(lián)反應發(fā)生變化。2)色氨酸是雜環(huán)族氨基酸，其環(huán)上帶有咪唑環(huán)，而精氨酸是脂肪族氨基酸。根據(jù)文獻報道，W39突變?yōu)楸彼?A)后，nGLP-1R失去了結合 GLP-1的能力[5]。由此可以推斷，氨基酸殘基上有無咪唑基團可能也會在很大程度上影響整個肽鏈結合 Exendin-4的活性。

由于Exendin-4與N端片段的結合活性要比GLP-1與N端片段的結合活性強，那么可以猜測其結合位點也是有所差別的，在wtEP16中，W39的缺失沒有影響exendin-4與受體N端片段的結合。但 EP16則由于其第 52位 (文獻[6]中的第72位氨基酸)氨基酸由W突變成了R而喪失了活性，那么可以推測，對于nGLP-1R來說，其與GLP-1的結合需要除W87外5個W的參與，但在nGLP-1R與Exendin-4作用時，W39的存在與否并不會影響到nGLP-1R與Exendin-4的結合，而W72(在本文中為第52位氨基酸)的突變則會影響到它們的結合。這個結果顯示，W72對受體N端片段與Exendin-4的結合的影響要大于W39。

表3 ELISA方法檢測噬菌體突變體EP16和野生型EP16結合Exendin-4的活性Table 3 Binding activity of the mutant EP16 and wtEP16 to Exendin-4 analyzed by ELISA

圖2 突變體EP16、野生型EP16、nGLP-1RW52R與野生型nGLP-1R的氨基酸序列的比較Fig. 2 Comparison of amino acid sequence between mutant EP16, wtEP16, nGLP-1RW52R and wtnGLP-1R.

3 結論

胰高血糖素樣肽1受體N端片段在缺失了前20個和后10個氨基酸仍具有生物學活性，但第52位保守氨基酸色氨酸的突變引起了活性的喪失。因此證明了氨基酸殘基的極性改變及有無咪唑基因都有可能會影響整個肽鏈結合 Exendin-4的活性。而關鍵位點單個氨基酸殘基的突變可以改變 nGLP-1R整個蛋白質的生物學活性。GLP-1R因在胰島素分泌和血糖調節(jié)方面有重要作用，基于對GLP-1R結構功能及其信號傳導通路的認識，建立相應的藥物篩選模型，尋找非肽類GLP-1R小分子激動劑，具有良好的科學價值和潛在的市場前景。本研究所建立的 nGLP-1R噬菌體隨機突變體庫能夠很好地應用于受體-配體的結合研究，稍加改造即可成為一個高能量篩選非肽類GLP-1R小分子激動劑的方法。

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