王國(guó)婧，王剛，董小巖，田文洪，尉遲捷，魏國(guó)超，孟紅，吳小兵

1 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250000

2 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所，北京 100052

3 北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所，北京 100176

4 吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012

5 北京亦莊國(guó)際生物醫(yī)藥投資管理有限公司，北京 100111

乙型肝炎病毒 (Hepatitis B virus，HBV)屬嗜肝DNA病毒科，是引起病毒性乙型肝炎的病原體[1]。全球約 1/3的人曾感染過(guò) HBV，慢性HBV感染者約3～4億，其中25%～40%人死于HBV感染相關(guān)性疾病[2]。我國(guó)屬于 HBV感染的高流行區(qū)，一般人群的 HBsAg陽(yáng)性率接近10%[3]。對(duì)現(xiàn)有病毒性乙型肝炎患者及 HBsAg攜帶者的防治工作，在今后幾十年里仍是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。

目前，治療乙型肝炎的藥物主要包括核苷酸類似物和干擾素等[4]，其中以核苷酸類似物臨床應(yīng)用最廣泛[5]。由于HBV耐藥突變株不斷出現(xiàn)[6]，使得現(xiàn)有抗 HBV藥物難以達(dá)到理想的治療效果，因此需要研發(fā)新的藥物。而新型乙肝藥物的篩查鑒定需要合適的HBV動(dòng)物模型。因小鼠容易獲得、研究背景清楚、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，HBV相關(guān)小鼠模型是理想的新型乙肝治療藥物的篩選動(dòng)物模型。

2010年本課題組利用高嗜肝性 8型重組腺相關(guān)病毒攜帶1.3個(gè)拷貝的HBV基因組 (ayw亞型)(Recombinant adeno-associated virus type 8 carrying 1.3 copies of HBV genome (ayw),rAAV8-1.3HBV)，體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)C57BL/6小鼠，成功制備乙型肝炎病毒持續(xù)感染小鼠模型[7]。該模型與HBV轉(zhuǎn)基因小鼠類似，小鼠體內(nèi)可持續(xù)檢測(cè)到HBeAg和HBsAg的表達(dá)以及HBV DNA的復(fù)制。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型已廣泛應(yīng)用于治療病毒性乙型肝炎核苷酸類似藥物的篩選和評(píng)價(jià)。為探討該模型是否也可用于新型核苷酸類抗 HBV藥物篩選和評(píng)價(jià)，本研究選用目前臨床治療病毒性乙型肝炎最常用的兩種核苷酸類似物 (拉米夫定和恩替卡韋)作用于該模型，對(duì)比給藥前后及停藥前后小鼠血清學(xué) HBV DNA、HBeAg、HBsAg檢測(cè)指標(biāo)的變化情況，判斷此模型能否反映核苷類藥物的抗HBV效果。

1 材料與方法

1.1 材料

4～6周齡雄性C57BL/6小鼠購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司；乙型肝炎病毒 (HBV)核酸定量檢測(cè)試劑盒 (PCR-熒光探針?lè)? (國(guó)藥準(zhǔn)字 S20020033)購(gòu)自深圳匹基生物有限公司；HBeAg、HBsAg定性診斷試劑盒購(gòu)自北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司；HBeAg、HBsAg定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abbott公司；恩替卡韋片 (國(guó)藥準(zhǔn)字H20052237)購(gòu)自中美上海施貴寶制藥有限公司；拉米夫定片 (國(guó)藥準(zhǔn)字 H20030581)購(gòu)自葛蘭素史克公司。

1.2 重組病毒rAAV8-1.3HBV的制備

重組腺相關(guān)病毒 rAAV8-1.3HBV由北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所制備和提供。主要步驟為：用pAAV2neo-1.3HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞后，800 μg/mL G418培養(yǎng)基選擇培養(yǎng) 15 d，得到BHK21/AAV-1.3HBV細(xì)胞；用攜帶rep2cap8基因的重組單純皰疹病毒 (MOI=1～5)感染BHK21/AAV-1.3HBV細(xì)胞，72 h收獲病變細(xì)胞以及培養(yǎng)上清液，按照吳小兵等報(bào)道的AAV載體純化方法[8]進(jìn)行粗純化，之后使用離子交換柱層析方法進(jìn)一步純化，點(diǎn)雜交方法測(cè)定病毒滴度。

1.3 動(dòng)物模型

將 rAAV8-1.3HBV病毒經(jīng)尾靜脈注射至30只 C57BL/6小鼠體內(nèi)。注射劑量為 1×1011vg/200 μL/只。注射病毒14、28和42 d后，分別小鼠尾靜脈采血，分離血清，測(cè)定血清中 HBeAg和HBsAg表達(dá)水平以及HBV DNA拷貝數(shù)，判斷模型構(gòu)建成功與否。

1.4 熒光定量PCR檢測(cè)血清HBV DNA

病毒注射后第42天、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中第5天、第10天、第25天4個(gè)時(shí)間點(diǎn)尾靜脈取血，分離血清，按照乙型肝炎病毒 (HBV)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光定量檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)檢測(cè)小鼠血清HBV DNA表達(dá)水平。

1.5 ELISA檢測(cè)小鼠血清HBeAg、HBsAg

病毒注射第14天和第28天后分別尾靜脈取血，分離血清，去離子水稀釋 20倍后，用萬(wàn)泰公司 HBeAg、HBsAg診斷試劑盒檢測(cè)小鼠血清HBeAg和HBsAg表達(dá)水平，檢測(cè)過(guò)程參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。兩項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)均為樣品OD450≥陰性對(duì)照孔平均值×2.1。

病毒注射第 42天以及實(shí)驗(yàn)第 10天和第 25天后分別尾靜脈取血，分離血清，生理鹽水稀釋40倍后，用Abbott公司的HBeAg、HBsAg定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)小鼠血清HBeAg和HBsAg表達(dá)水平，檢測(cè)過(guò)程參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。陽(yáng)性參考值分別為：HBeAg (S/CO)＞1，HBsAg (mIU/mL)＞0.05。

1.6 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示，分為建立、篩選慢性HBV感染小鼠模型并對(duì)該模型的成模率進(jìn)行評(píng)價(jià)，以及評(píng)價(jià)核苷酸類似物藥物作用效果兩個(gè)階段。具體如下所述。

1.6.1 實(shí)驗(yàn)分組

根據(jù)病毒注射第14天和第28天后每只小鼠的 HBeAg、HBsAg表達(dá)定性檢測(cè)結(jié)果，以及第42天 (藥物處理0 d) 后HBeAg、HBsAg和HBV DNA的定量檢測(cè)結(jié)果，從 30只注射 rAAV8-1.3HBV小鼠中挑選27只小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。挑選出的27只小鼠各自HBV DNA表達(dá)水平都大于1×105IU/mL，HBeAg和HBsAg在第14天和第 28天時(shí)的定性檢測(cè)均為陽(yáng)性，且第 42天時(shí)HBeAg、HBsAg和HBV DNA的定性檢測(cè)結(jié)果都較高。用隨機(jī)數(shù)表法，對(duì)挑選出的 27只模型小鼠進(jìn)行分組，其中空白對(duì)照組 (Untreated) 5只、生理鹽水組 (NS) 4只、ETV高劑量組(1.0 mg/(kg?d))5只、ETV低劑量組 (0.1 mg/(kg?d))4只、LAM高劑量組 (500 mg/(kg?d))5只、LAM低劑量組 (100 mg/(kg?d))4只。

1.6.2 藥品

恩替卡韋、拉米夫定研成粉末，損失量以每片20%計(jì)算，生理鹽水配置藥品溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3 處理

根據(jù) 1.6.1中小鼠模型分組時(shí)設(shè)定的每組給藥種類和劑量給藥。每組小鼠以灌胃方式連續(xù)給藥10 d (第1～10天)，每日1次，之后停藥15 d(第11～25天)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，第0天、第5天、第10天和第 25天，分別尾靜脈采血，分離血清，?20 ℃保存?zhèn)溆?。?25天采血后，處死全部小鼠。

1.6.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

圖1 實(shí)驗(yàn)流程示意圖Fig. 1 The schematic map of procedure for experiment. In the whole of experiment process, mouse model of HBV chronic infection was firstly established by injection of rAAV8-1.3HBV and determination of model. Then suitable models were chosen, different kinds of drugs were given and effects of drugs on model were assessed.

采用成組 t檢驗(yàn)分析相對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn) (0 d、10 d和25 d)給藥組與NS組的血清學(xué)HBV DNA表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析給藥組給藥前后和停藥前后的HBV DNA表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HBeAg、HBsAg定量檢測(cè)兩項(xiàng)指標(biāo)分別采用成組 t檢驗(yàn)分析相對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn) (0 d、10 d和25 d)給藥組與NS組的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析給藥組給藥前后和停藥前后的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上分析過(guò)程均采用 SPSS16.0軟件分析完成。

2 結(jié)果

2.1 小鼠成模情況

將 rAAV8-1.3HBV病毒經(jīng)尾靜脈注射至 30只C57BL/6小鼠體內(nèi)，第14天和第28天后分別對(duì)30只小鼠采血并定性檢測(cè) HBeAg和HBsAg表達(dá)水平。結(jié)果顯示，第14天除11號(hào)、25號(hào)小鼠HBeAg檢測(cè)結(jié)果為陰性外，其余小鼠均為陽(yáng)性；30只小鼠HBsAg檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。第28天除25號(hào)小鼠HBeAg檢測(cè)結(jié)果為陰性外，其余小鼠均為陽(yáng)性；同時(shí)各小鼠 HBsAg檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。第 42天定量檢測(cè)小鼠血清學(xué) HBV DNA、HBeAg、HBsAg的表達(dá)水平，結(jié)果如圖2所示。30只小鼠血清學(xué) HBV DNA表達(dá)情況(lg (IU/mL))，除11號(hào)小鼠為4.13，25號(hào)小鼠為3.85，28號(hào)小鼠為4.46以外，其余27只小鼠均大于 5.00，平均值為 5.38±0.34。進(jìn)一步定量檢測(cè)小鼠血清HBeAg及HBsAg的表達(dá)情況。以上3只血清HBV DNA表達(dá)水平較低的小鼠情況如下：11號(hào)小鼠HBeAg表達(dá)為2.00 S/CO，HBsAg表達(dá)為23.07 mIU/mL；25號(hào)小鼠HBeAg表達(dá)為1.13 S/CO，HBsAg表達(dá)為8.10 mIU/mL；28號(hào)小鼠HBeAg表達(dá)為8.27 S/CO，HBsAg表達(dá)為81.54 mIU/mL。其他27只小鼠血清HBeAg平均值 13.22±1.78 S/CO，最低值為 9.50 S/CO；HBsAg平均值 93.24±7.24 mIU/mL，最低值為81.69 mIU/mL。結(jié)合血清HBV DNA表達(dá)水平及HBeAg、HBsAg情況，在 30只小鼠中剔除 11號(hào)、25號(hào)、28號(hào)小鼠，挑選其他27只小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 藥物處理對(duì)小鼠模型血清HBV DNA的影響

圖2 HBV慢性感染小鼠模型的確定Fig. 2 Determination of mouse model of HBV chronic infection. Thirty mice were injected with rAAV8-1.3HBV. Forty-two days post-injection, HBsAg, HBeAg,and HBV DNA titer in sera were assayed. Mouse whose HBV DNA, HBsAg (40-fold diluted), and HBeAg(40-fold diluted)titer in sera was separately more than 5.00 (lg(IU/mL)), 81.00 mIU/mL, and 9.50 S/CO was determined as model. Twenty-seven mice were chose as models. The hollow circles indicated the mouse model of HBV chronic infection; the solid circles indicated the mice which were not determined as models.

rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的HBV持續(xù)感染小鼠模型成功建立后，按照 ETV高、低劑量分別給藥10 d后停藥15 d，尾靜脈取血檢測(cè)血清學(xué)HBV DNA的變化情況，結(jié)果見(jiàn)表1。相同時(shí)間點(diǎn)ETV低劑量組與生理鹽水組對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)給藥10 d后相比于生理鹽水組，ETV低劑量組血清學(xué)HBV DNA表達(dá)水平下降顯著，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。不同時(shí)間點(diǎn) ETV低劑量組組內(nèi)對(duì)比(圖3)，給藥5 d與0 d相比，血清學(xué)HBV DNA表達(dá)水平 (lg (IU/mL))由 5.31±0.42下降到4.54±0.46，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)；給藥10 d與0 d相比，下降到4.26±0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)；停藥15 d與給藥10 d對(duì)比，HBV DNA表達(dá)水平有所反彈，上升到4.57±0.14，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。

相同時(shí)間點(diǎn)血清 HBV DNA表達(dá)水平 ETV高劑量組與生理鹽水組對(duì)比分析 (表1)，相比于生理鹽水組，ETV高劑量組給藥5 d即出現(xiàn)顯著下降，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)；給藥10 d繼續(xù)下降，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)；停藥15 d差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)。不同時(shí)間點(diǎn) ETV高劑量組組內(nèi)對(duì)比分析 (圖 3)，給藥5 d與0 d相比，血清學(xué)HBV DNA表達(dá)水平(lg (IU/mL))由 5.36±0.36 下降到 4.29±0.18，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)；給藥10 d與0 d相比，下降至 3.75±0.21，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；停藥第15天與給藥第10天相比變化甚微，為3.69±0.27。

表1 ETV和LAM分別作用于rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的HBV持續(xù)感染小鼠模型后不同時(shí)間點(diǎn)血清HBV DNA情況Table 1 HBV DNA titer in sera of HBV chronic infection mouse model mediated by rAAV8-1.3HBV at different time points treated with ETV or LAM

圖3 rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的HBV持續(xù)感染小鼠模型血清中HBV DNA表達(dá)隨時(shí)間的變化情況Fig. 3 HBV DNA titer in sera of the HBV chronic infectious mice models mediated by rAAV8-1.3HBV at different time points. Mice models of HBV chronic infection were continuously treated by drugs day by day for 10 days. Then drugs were withdrew and lasted for fifteen days. At different time points in the process, HBV DNA titer in sera was tested.

rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的HBV持續(xù)感染小鼠模型成功建立后，按照LAM高、低劑量分別給藥10 d后停藥15 d，尾靜脈取血檢測(cè)血清學(xué)HBV DNA變化情況，結(jié)果如表 1所示。相同時(shí)間點(diǎn)LAM 低劑量組與生理鹽水組對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)給藥10 d后相比于生理鹽水組，LAM低劑量組血清學(xué)HBV DNA表達(dá)水平也顯著下降，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。而不同時(shí)間點(diǎn)LAM低劑量組組內(nèi)對(duì)比分析，給藥5 d與0 d相比，血清學(xué) HBV DNA表達(dá)水平 (lg (IU/mL))由5.22±0.17下降到 4.91±0.22，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)；給藥 10 d與 0 d相比，下降到4.42±0.22，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)；停藥15 d后與給藥第10天對(duì)比，HBV DNA表達(dá)水平反彈，上升到 5.10±0.49，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。

同理，相同時(shí)間點(diǎn)血清HBV DNA表達(dá)水平LAM 高劑量組與生理鹽水組對(duì)比分析 (表 1)，相比于生理鹽水組，LAM高劑量組給藥10 d出現(xiàn)顯著下降，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)；停藥15 d差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)。不同時(shí)間點(diǎn)LAM高劑量組組內(nèi)對(duì)比分析 (圖3)，給藥5 d與0 d相比，血清學(xué)HBV DNA表達(dá)水平 (lg (IU/mL))由 5.61±0.42 下降到 4.63±0.40，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)；給藥10 d與0 d相比，下降至 4.32±0.32，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；停藥第15天與給藥第10天相比變化甚微，為 4.17±0.28。此外，實(shí)驗(yàn)全程中生理鹽水組略有下降，但各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，未處理組血清學(xué)HBV DNA表達(dá)水平平穩(wěn)，無(wú)明顯變化，且相同時(shí)間點(diǎn)生理鹽水組和未處理空白組間HBV DNA表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 藥物處理對(duì)小鼠血清中 HBeAg、HBsAg水平的影響

檢測(cè)ETV給藥前后和停藥前后血清中HBeAg表達(dá)水平，即第 0天、第 10天、第 25天時(shí)的HBeAg表達(dá)水平，結(jié)果如圖4A所示，所有結(jié)果均為血清40倍稀釋后的測(cè)定值。ETV低劑量組第0天時(shí)HBeAg表達(dá)水平為13.49±1.72 S/CO，給藥10 d后為13.28±1.87 S/CO，停藥15 d后為13.26±1.60 S/CO，實(shí)驗(yàn)全程中HBeAg表達(dá)無(wú)明顯變化，未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ETV高劑量組第 0天表達(dá)為 12.44±1.93 S/CO，給藥 10 d為13.05±1.74 S/CO，停藥 15 d為 12.55±1.64 S/CO，全程HBeAg表達(dá)無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，空白對(duì)照組、生理鹽水組全程血清HBeAg表達(dá)水平無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的HBV持續(xù)感染小鼠模型血清中HBeAg、HBsAg表達(dá)隨時(shí)間的變化情況Fig. 4 HBeAg and HBsAg titer in the HBV chronic infectious mice models mediated by rAAV8-1.3HBV at different time points. (A)The HBeAg titer. (B)The HBsAg titer.

檢測(cè) ETV給藥前后血清中 HBsAg表達(dá)水平，即第0天、第10天、第25天時(shí)的HBeAg表達(dá)水平，結(jié)果如圖4B所示，所有結(jié)果均為血清40倍稀釋后的測(cè)定值。ETV低劑量組第0天時(shí)HBsAg表達(dá)水平為94.43±6.48 mIU/mL，給藥 10 d為 94.10±5.67 mIU/mL，停藥 15 d為91.76±7.71 mIU/mL，實(shí)驗(yàn)全程中HBsAg表達(dá)無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ETV高劑量組第0天時(shí)HBsAg表達(dá)水平為90.02±7.42 mIU/mL，給藥10 d為90.01±6.47 mIU/mL，停藥15 d為91.01±6.94 mIU/mL，實(shí)驗(yàn)全程中HBsAg表達(dá)也無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？瞻讓?duì)照組、生理鹽水組全程血清 HBsAg表達(dá)水平無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

檢測(cè) LAM給藥前后血清中 HBeAg表達(dá)水平，即第0天、第10天、第25天時(shí)的HBeAg表達(dá)水平，結(jié)果如圖4A所示，所有結(jié)果均為血清40倍稀釋后的測(cè)定值。LAM低劑量組第0天時(shí)HBeAg表達(dá)為14.22±0.91 S/CO，給藥10 d為12.65±2.00 S/CO，停藥 15 d為 13.43±1.41 S/CO，實(shí)驗(yàn)全程HBeAg表達(dá)無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LAM高劑量組在第0天時(shí)HBeAg表達(dá)為14.65±1.38 S/CO，給藥 10 d為 14.29±1.82 S/CO，停藥15 d為14.57±1.50 S/CO，實(shí)驗(yàn)全程HBeAg表達(dá)無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

檢測(cè) LAM給藥前后血清中 HBsAg表達(dá)水平，即第0天、第10天、第25天時(shí)的HBeAg表達(dá)水平，結(jié)果如圖4B所示，所有結(jié)果均為血清 40倍稀釋后的測(cè)定值。LAM 低劑量組第 0天時(shí) HBsAg表達(dá)為 93.42±9.41 mIU/mL，給藥10 d為 90.99±6.77 mIU/mL，停藥 15 d為92.33±8.35 mIU/mL，實(shí)驗(yàn)全程HBsAg表達(dá)無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LAM高劑量組第0天時(shí) HBsAg表達(dá)為 96.61±8.23 mIU/mL，給藥10 d為 93.62±8.73 mIU/mL，停藥 15 d為93.16±6.30 mIU/mL，實(shí)驗(yàn)全程HBsAg表達(dá)也無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

小鼠由于缺乏HBV病毒進(jìn)入及脫殼所需的特異性受體和某些因子，無(wú)法直接應(yīng)用感染性乙型肝炎病毒接種的方法制備模型[9]。現(xiàn)有的小鼠模型是借助其他手段將HBV基因組導(dǎo)入到肝臟或者直接利用轉(zhuǎn)基因方法制備的。近來(lái)本課題組用攜帶1.3拷貝HBV基因組的重組8型腺相關(guān)病毒 (rAAV8-1.3HBV)成功在具有正常免疫力的 C57BL/6小鼠體內(nèi)建立了 HBV持續(xù)感染模型，該模型在小鼠肝細(xì)胞中自發(fā)回復(fù)形成染色體外環(huán)狀閉合HBV基因組DNA，在血清中持續(xù)檢測(cè)到HBeAg及HBsAg表達(dá)，在肝臟及血清均持續(xù)檢測(cè)到HBV DNA。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的HBV持續(xù)感染小鼠模型與現(xiàn)有小鼠模型相比，主要存在以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。與轉(zhuǎn)基因小鼠相比，該模型應(yīng)用免疫功能正常的成體小鼠，沒(méi)有轉(zhuǎn)基因小鼠在胚胎發(fā)育過(guò)程中對(duì)HBV DNA形成的免疫耐受過(guò)程[10-11]；模型制備操作過(guò)程簡(jiǎn)單可控；模型血清中HBV DNA水平一致性好，各組組內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差??；初始建模病毒量高低、建模時(shí)間可控。更為重要的是以本研究所用的小鼠模型為基礎(chǔ)，可以很方便地獲得HBV耐藥突變株的動(dòng)物模型。這有利于研究目前臨床應(yīng)用核苷酸類似物后出現(xiàn)的耐藥突變問(wèn)題[12]，為耐藥株篩選抗HBV敏感的新藥物。此外，本模型與應(yīng)用水動(dòng)力方法的建立的HBV小鼠模型[13-14]相比，具有HBV DNA表達(dá)穩(wěn)定，水平集中，時(shí)間長(zhǎng)久，成功率高等優(yōu)點(diǎn)。

基于上述一系列優(yōu)點(diǎn)，對(duì)rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的HBV持續(xù)感染小鼠模型應(yīng)用已上市最常用的兩種核苷酸類似物 (ETV和LAM)，觀察兩藥在該模型中的抗HBV作用效果。ETV是鳥(niǎo)嘌呤核苷類似物，LAM 是胞嘧啶核苷類似物，兩種藥物均通過(guò)形成三磷酸鹽形式而表現(xiàn)活性[15-16]，主要作用于病毒逆轉(zhuǎn)錄酶位點(diǎn)[17-18]。HBV復(fù)制需要利用逆轉(zhuǎn)錄酶以病毒 pg RNA (Pregenomic RNA)為模板逆轉(zhuǎn)錄生成負(fù)鏈 DNA (Minusstrand DNA)，然后合成RC DNA (Relaxed circular DNA)和 DSL DNA (Double-stranded linear DNA)[19]。這一步是核苷酸類似物藥物阻斷HBV復(fù)制、產(chǎn)生抗HBV效果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)觀察了用藥前后模型小鼠血清HBV DNA、HBeAg、HBsAg的變化情況。

首先初步評(píng)估了 rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的小鼠成模情況。在第 14天、第 28天進(jìn)行血清學(xué)HBeAg及HBsAg定性檢測(cè)。在30只小鼠中初步選擇前后兩次檢測(cè)兩項(xiàng)指標(biāo)均為陽(yáng)性的小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，由第 42天小鼠血清 HBV DNA表達(dá)水平 (lg (IU/mL))觀察可見(jiàn)，30只小鼠中27只大于5.0。本實(shí)驗(yàn)中，我們將小鼠血清HBV DNA表達(dá)水平 (lg (IU/mL))大于5.0定為陽(yáng)性模型篩選標(biāo)準(zhǔn)。在 30只小鼠中進(jìn)一步篩選出 27只作為構(gòu)建成功的小鼠模型。結(jié)合小鼠血清 HBeAg、HBsAg兩項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)情況分析，被剔除的3只小鼠血清HBeAg、HBsAg的表達(dá)水平，明顯低于其余27只小鼠血清HBeAg表達(dá)水平的平均值 (13.22±1.78 S/CO)和 HBsAg表達(dá)水平的平均值 (93.24±7.24 mIU/mL)。因此，在30只小鼠中最終挑選出27只用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本次實(shí)驗(yàn)，rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的 HBV持續(xù)感染小鼠模型通過(guò)尾靜脈注射的方法構(gòu)建成功，成模率達(dá)90%，反映了該模型制備簡(jiǎn)單、成模率高的特點(diǎn)。

對(duì)已建立的rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的HBV持續(xù)感染小鼠模型應(yīng)用核苷酸類似物后發(fā)現(xiàn)，ETV及 LAM 兩藥高、低劑量組均對(duì)小鼠血清 HBV DNA產(chǎn)生明顯抑制效果。其中，兩種藥物高劑量組對(duì)小鼠血清HBV DNA的抑制作用明顯強(qiáng)于低劑量組。給藥過(guò)程中隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，所有給藥組小鼠模型血清HBV DNA表達(dá)水平逐漸下降。給藥停止前，即給藥10 d后，所有給藥組小鼠血清HBV DNA水平下降至給藥全程最低值。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，未處理組血清HBV DNA水平未觀察到改變。而生理鹽水組血清HBV DNA水平有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能由反復(fù)灌胃刺激引起。此外，無(wú)論給藥5 d或10 d后ETV高、低劑量組對(duì)小鼠血清HBV DNA抑制效果均強(qiáng)于LAM高、低劑量組，這一現(xiàn)象與兩種藥物在臨床實(shí)際應(yīng)用中的情況相符[20-21]。停藥15 d與給藥10 d相比，兩種藥物低劑量組小鼠血清HBV DNA水平出現(xiàn)明顯上升，提示低劑量組出現(xiàn)停藥反彈現(xiàn)象，這也與臨床情況吻合[22]。

與小鼠血清HBV DNA表達(dá)水平出現(xiàn)明顯變化形成鮮明對(duì)比的是血清ELISA結(jié)果。無(wú)論高、低劑量給藥組或生理鹽水組、空白對(duì)照組，小鼠血清 HBeAg、HBsAg給藥前后、停藥前后表達(dá)穩(wěn)定，未出現(xiàn)明顯改變。這可能是因?yàn)楹塑账犷愃莆锼幬镒饔糜谀孓D(zhuǎn)錄酶位點(diǎn)，能夠有效地抑制以pg RNA為模板的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中DNA的合成，降低新合成的HBV DNA產(chǎn)量。但核苷酸類似物不能夠清除細(xì)胞中原有的HBV DNA量，即轉(zhuǎn)錄時(shí)需要的模板，也不能夠抑制轉(zhuǎn)錄過(guò)程，因此細(xì)胞中HBeAg和HBsAg表達(dá)過(guò)程可能不受核苷酸類似物影響，用藥前后表達(dá)水平未見(jiàn)明顯變化。該模型中的這一現(xiàn)象，也與轉(zhuǎn)基因小鼠模型應(yīng)用核苷酸類似物后，血清學(xué)HBV DNA明顯下降，HBeAg、HBsAg無(wú)明顯變化的現(xiàn)象相類似[23-26]。

對(duì)rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的HBV持續(xù)感染的小鼠模型應(yīng)用核苷酸類似物后，小鼠血清 HBV DNA表達(dá)水平下降，而血清HBeAg、HBsAg表達(dá)水平未見(jiàn)明顯改變。該模型能夠客觀真實(shí)地反映現(xiàn)有核苷酸類似物的抗HBV效果，同時(shí)具有制備簡(jiǎn)單、成模率高的特點(diǎn)，可以作為新的抗HBV核苷酸類似物篩選評(píng)價(jià)模型進(jìn)行進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

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