邱鵬，寧昆，蔡林，劉奇，汪葆玥，翟新驗(yàn)，遇秀玲，倪建強(qiáng)，田克恭

中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 OIE豬繁殖與呼吸綜合征參考實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心，北京 100125

豬繁殖與呼吸綜合征 (Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS) 是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的，以母豬繁殖障礙、早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及仔豬呼吸綜合征為特征的高度接觸性傳染病，是威脅全球養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病[1-2]。PRRSV分離株根據(jù)抗原性和核酸序列上的差異[3-4]，可以分為歐洲型 (EU)和美洲型 (NA)毒株，雖然兩種毒株引起的臨床癥狀相似，但抗原性差異較大，診斷技術(shù)和防控疫苗等均有不同，快速、準(zhǔn)確的分型診斷技術(shù)是防控該病的重要基礎(chǔ)[5]。

1995年，我國首次暴發(fā)PRRS，其病原為美洲型 PRRSV，隨后該病蔓延至全國各地，成為影響我國養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病[6]。2006年我國暴發(fā)了由美洲型 PRRSV變異毒株引起的高致病性PRRS，以高度接觸性傳播、全身出血、發(fā)病率高、死亡率高為主要臨床特征，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了沉重打擊[7-9]。近年來，歐洲型PRRSV在我國豬場的發(fā)生也屢有報(bào)道，學(xué)者們相繼從浙江、福建、內(nèi)蒙古和北京等地分離到多株歐洲型PRRSV[10-11]。美洲型和歐洲型PRRSV在我國豬群中的廣泛流行預(yù)示我國急需建立可用于分型檢測的診斷技術(shù)，以滿足該病防控的需要。

美洲型和歐洲型PRRSV毒株基因組核苷酸序列同源性為 55%～80%，ORF1a編碼的 Nsp7蛋白在型間免疫原性差異顯著，可用于研制PRRSV的血清學(xué)分型診斷技術(shù)[12-14]。本研究通過體外基因重組表達(dá)技術(shù)，獲得了缺失相似抗原表位的美洲型和歐洲型PRRSV Nsp7截短蛋白，為PRRSV感染的血清學(xué)分型檢測技術(shù)的研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、菌株、病毒、血清和細(xì)胞

表達(dá)載體pET-32a由本實(shí)驗(yàn)室保存；表達(dá)菌株 Transetta (DE3)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。美洲型PRRSV JXA1株 (EF112445)、歐洲型 PRRSV BJEU06-1株 (GU047344)以及美洲型和歐洲型PRRSV參考陽性血清、PRRSV陰性血清各 3份均由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。Marc-145傳代細(xì)胞和原代豬肺泡巨嗜細(xì)胞(PAM)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 酶和主要試劑

AMV反轉(zhuǎn)錄酶、Rnase抑制劑、Go Taq DNA聚合酶均購自 Promega公司。限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、Hind Ⅲ購自TaKaRa公司。RNA 提取試劑盒 (RNeasy? Mini Kit)購自QIAGEN 公司。膠回收試劑盒 (E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit)、質(zhì)?；厥赵噭┖?(E.Z.N.A.?Plasmid Mini Kit)購自O(shè)MEGA公司。蛋白純化試劑 (Ni-NTA His?Bind 樹脂柱)為 Invitrogen 公司產(chǎn)品。IPTG、HRP標(biāo)記兔抗豬IgG及其他化學(xué)試劑購自Sigma公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank公布的PRRSV美洲型和歐洲型毒株基因組序列 (登錄號分別為 EF112445和GU047344)，利用Oligo 6軟件設(shè)計(jì)PCR及融合PCR所用引物，用于擴(kuò)增獲得完整 Nsp7基因(NA-Nsp7和 EU-Nsp7)和相似抗原表位編碼序列缺失的基因片段(NA-?Nsp7 和 EU-?Nsp7)。引物序列和PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物大小見表1。

1.3 病毒的增殖及基因組的提取

將已長成單層的Marc-145細(xì)胞和PAM細(xì)胞棄去生長液，按 1% (V/V)分別接種美洲型PRRSV JXA1株和歐洲型PRRSV BJEU06-1株，加入含2%牛血清的DMEM或RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)觀察3～5 d，當(dāng)70%以上細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)收獲，置-40 ℃下凍融2次，-70 ℃保存，備用。使用RNA提取試劑盒提取病毒基因組。

1.4 美洲型和歐洲型PRRSV Nsp7基因的克隆和表達(dá)

以提取的病毒基因組為模板進(jìn)行 RT-PCR，擴(kuò)增體系為：5×Buffer 5 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，Go Taq酶1 μL，基因組RNA模板1 μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶 0.3 μL，RNase 抑制劑 0.2 μL，RNase free dH2O 13.5 μL。反應(yīng)條件為：42 ℃ 45 min ；94 ℃5 min；94 ℃ 1 min ，52 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 1 0 min。PCR產(chǎn)物膠回收純化后，經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化，回收目的片段定向克隆于pET-32a表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化Transetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR鑒定篩選獲得陽性菌落。

表1 基因克隆所用的引物和PCR預(yù)期產(chǎn)物大小Table 1 Primers used for gene cloning and expected PCR products

將陽性菌落接種到含卡那霉素 (50 mg/L)LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6時(shí)加入IPTG至終濃度1 mmol/ L，誘導(dǎo)3 h，同時(shí)設(shè)誘導(dǎo)的空載體作對照，收集菌體采用超聲波裂解處理 (200 W，間隔10 s，共超聲作用30次)，12 000 r/min離心20 min，分別收集上清液及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE。

1.5 表達(dá)產(chǎn)物的純化和鑒定

表達(dá)菌體經(jīng)超聲波裂解后收集上清液，用Ni-NTA His?Bind樹脂柱按說明書推薦的可溶性蛋白純化方法純化蛋白，用紫外分光光度計(jì)測定蛋白含量后進(jìn)行 SDS-PAGE檢測和 Western blotting鑒定。具體過程為：取純化的重組蛋白經(jīng) SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上，用0.01 mol/L PBS (pH 7.4)配制的3%脫脂乳封閉液 37 ℃作用 1 h，經(jīng) PBST (加入0.1% Tween 20的PBS)漂洗3次，每次3 min，之后加入1∶500稀釋的PRRSV陽性血清，37 ℃作用1 h，用PBST同樣方法漂洗3次，每次3 min，加入HRP酶標(biāo)兔抗豬IgG 抗體 (1:30 000)，37 ℃作用1 h，洗滌后加入底物 TMB與過氧化物酶溶液，顯色15 min，蒸餾水終止反應(yīng)。

1.6 美洲型和歐洲型PRRSV Nsp7的相似抗原表位分析

運(yùn)用DNAstar軟件，分析PRRSV Nsp7的抗原性 (Antigenicity)、Hopp-Woods親水性(Hydrophilicity)、可接近性 (Accessibility)、主鍵活動(dòng)性 (Flexibility)和抗原決定簇(Determinant)，研究美洲型與歐洲型PRRSV Nsp7的相似抗原表位。

1.7 美洲型和歐洲型PRRSV Nsp7的截短表達(dá)和鑒定

以克隆獲得的含歐洲型或美洲型Nsp7基因的pET-32a載體為模板，采用PCR分段擴(kuò)增Nsp7基因片段，NA-Nsp7基因片段分別為103 bp (引物 NA-Nsp7F 和 NA-Nsp7R1)和 636 bp (引物NA-Nsp7F2和 NA-Nsp7R)；EU-Nsp7基因片段分別為 103 bp (引物 EU-Nsp7F和 EU-Nsp7R3)和668 bp (引物EU-Nsp7F4和EU-Nsp7R)?；厥丈鲜銎?，分別用 NA-Nsp7F/NA-Nsp7R和EU-Nsp7F/EU-Nsp7R進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增，獲得相似抗原表位編碼序列缺失的基因片段 (缺失24～58aa的編碼序列)。

回收目的片段定向克隆于pET-32a載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng) PCR鑒定獲得陽性轉(zhuǎn)化菌落。利用Ni-NTA His?Bind樹脂柱純化獲得重組蛋白 NA-?Nsp7和 EU-?Nsp7，測定純化蛋白含量，進(jìn)行 SDS-PAGE檢測和 Western blotting鑒定。

2 結(jié)果

2.1 美洲型和歐洲型PRRSV Nsp7基因的克隆和表達(dá)

以Marc-145細(xì)胞和PAM細(xì)胞培養(yǎng)的美洲型PRRSV JXA1株和歐洲型PRRSV BJEU06-1株為模板，擴(kuò)增獲得NA-Nsp7和EU-Nsp7編碼基因，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下可見794 bp和825 bp的目的條帶 (圖1)，目的片段定向克隆于表達(dá)載體pET 32a中，誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE分析表明，NA-Nsp7和EU-Nsp7在大腸桿菌中均獲得了高效表達(dá)，所表達(dá)的蛋白大小約為47 kDa，與預(yù)期大小相符，超聲波處理后所表達(dá)蛋白主要集中在上清液中，蛋白為可溶性表達(dá) (圖2)。

2.2 表達(dá)產(chǎn)物的純化和鑒定

將NA-Nsp7和EU-Nsp7表達(dá)菌株經(jīng)誘導(dǎo)、收集、超聲波裂解，之后收集上清液，用親和層析法純化，重組蛋白的濃度測定分別為0.8 mg/mL和1.5 mg/mL。取純化產(chǎn)物 (上樣量均為5 μL)進(jìn)行SDS-PAGE檢測，結(jié)果表明蛋白純度高，無明顯的非特異性條帶 (圖 3)。取重組NA-Nsp7 和 EU-Nsp7 各 2 μg、1 μg 分別與美洲型或歐洲型PRRSV陽性血清、陰性血清各3份進(jìn)行Western blotting反應(yīng)，結(jié)果均顯示，純化的NA-Nsp7和 EU-Nsp7分別與美洲型和歐洲型PRRSV陽性血清發(fā)生較強(qiáng)的特異性反應(yīng)；同時(shí)，NA-Nsp7與歐洲型PRRSV陽性血清，EU-Nsp7與美洲型PRRSV陽性血清有微弱的免疫反應(yīng)，所純化的重組蛋白不能有效用于美洲型和歐洲型PRRSV血清抗體的分型檢測 (圖3)，重組蛋白與陰性血清之間無特異性雜交條帶 (數(shù)據(jù)未顯示)。

圖1 NA-Nsp7和EU-Nsp7的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 1 RT-PCR products of NA-Nsp7 and EU-Nsp7.M: DL2000 DNA marker; 1: negative control; 2:EU-Nsp7; 3: NA-Nsp7.

圖2 NA-Nsp7和EU-Nsp7表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖譜Fig. 2 Over-expression of NA-Nsp7 and EU-Nsp7 in E. coli analyzed by SDS-PAGE. (A)Protein of pET 32a-NA-Nsp7. (B)Protein of pET 32a-EU-Nsp7. M: protein marker; 1, 5: un-induced control; 2, 6: pET 32a vector control;3: sediment protein of pET 32a-NA-Nsp7 after inducing; 4: soluble protein of pET 32a-NA-Nsp7 after inducing; 7:sediment protein of pET 32a-EU-Nsp7 after inducing; 8: soluble protein of pET 32a-EU-Nsp7 after inducing.

圖3 純化NA-Nsp7和EU-Nsp7的SDS-PAGE和Western blotting鑒定結(jié)果Fig. 3 Identification of purified NA-Nsp7 and EU-Nsp7 by SDS-PAGE and Western blotting. (A)SDS-PAGE of purified NA-Nsp7and EU-Nsp7 expressed in E. coli. (B?E)Western blotting of NA-Nsp7and EU-Nsp7protein expressed in E. coli interacting with antibodies against NA-PRRSV or EU-PRRSV. M: protein marker; 1: NA-Nsp7 protein; 2: EU-Nsp7 protein; 3?4: NA-Nsp7 interacting with antibodies against NA-PRRSV (2 μg and 1 μg loading respectively); 5?6: NA-Nsp7 protein interacting with antibodies against EU-PRRSV (2 μg and 1 μg loading respectively); 7?8: EU-Nsp7 protein interacting with antibodies against EU-PRRSV (2 μg and 1 μg loading respectively); 9?10: EU-Nsp7 interacting with antibodies against NA-PRRSV (2 μg and 1 μg loading respectively).

2.3 美洲型和歐洲型PRRSV Nsp7相似抗原表位的分析

經(jīng) DNAstar軟件分析，預(yù)測 NA-Nsp7和EU-Nsp7分別包含有10個(gè)和11個(gè)抗原表位，其中 NA-Nsp7的第 1個(gè)和第 2個(gè)表位分別與EU-Nsp7的第2個(gè)和第3個(gè)表位在氨基酸序列、疏水圖譜上較為相似 (24～58aa)，推測是抗原抗體交叉免疫反應(yīng)的主要表位 (表2)。

表2 美洲型和歐洲型PRRSV Nsp7的抗原表位預(yù)測Table 2 Prediction of antigenic epitopes of Nsp7 of NA and EU-PRRSV

2.4 美洲型和歐洲型PRRSV Nsp7的截短表達(dá)和鑒定

缺失相似抗原表位 (24～58aa)的編碼序列，美洲型和歐洲型PRRSV Nsp7的基因片段大小分別為672 bp和702 bp (圖4)。將目的片段定向克隆于pET-32a載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)表達(dá)和純化獲得重組蛋白 NA-?Nsp7和 EU-?Nsp7，重組蛋白濃度分別為 1.3 mg/mL和 1.0 mg/mL。SDS-PAGE檢測 (上樣量均為5 μL)表明蛋白純度高，無明顯的非特異性條帶 (圖5)。取重組蛋白 NA-?Nsp7 和 EU-?Nsp7 各 4 μg、2 μg、1 μg分別與美洲型或歐洲型PRRSV陽性血清、陰性血清各3份進(jìn)行Western blotting反應(yīng)，結(jié)果均顯示，純化蛋白NA-?Nsp7和EU-?Nsp7分別與美洲型和歐洲型PRRSV陽性血清發(fā)生較強(qiáng)的特異性反應(yīng)；蛋白NA-?Nsp7與歐洲型PRRSV陽性血清，蛋白EU-?Nsp7與美洲型PRRSV陽性血清無交叉免疫反應(yīng) (圖5)，且重組蛋白與陰性血清之間無特異性雜交條帶 (數(shù)據(jù)未顯示)，所純化的重組蛋白可用于美洲型和歐洲型PRRSV血清抗體的分型檢測。

圖4 NA-?Nsp7和EU-?Nsp7基因片段的融合PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 4 Fusion PCR products of NA-?Nsp7 and EU-?Nsp7. M: DL2000 DNA marker; 1: negative control; 2: EU-?Nsp7; 3: NA-?Nsp7.

圖5 純化NA-?Nsp7和EU-?Nsp7的SDS-PAGE和Western blotting鑒定Fig. 5 Analysis and identification of NA-?Nsp7 and EU-?Nsp7 by SDS-PAGE and Western blotting. (A)SDS-PAGE of purified NA-?Nsp7 and EU-?Nsp7 protein expressed in E. coli. (B?E)Western blotting of NA-?Nsp7 and EU-?Nsp7 protein expressed in E. coli, interacting with antibodies against NA-PRRSV or EU-PRRSV. M: protein marker; 1: NA-?Nsp7 protein; 2: EU-?Nsp7 protein; 3?5: NA-?Nsp7 interacting with antibodies against NA-PRRSV(4 μg, 2 μg and 1 μg loading respectively); 6?8: NA-?Nsp7 protein interacting with antibodies against EU-PRRSV(4 μg, 2 μg and 1 μg loading respectively); 9?11: EU-?Nsp7 protein interacting with antibodies against EU-PRRSV(4 μg, 2 μg and 1 μg loading respectively); 12?14: EU-?Nsp7 interacting with antibodies against NA-PRRSV (4 μg,2 μg and 1 μg loading respectively).

3 討論

豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組為單股正鏈不分節(jié)段RNA分子，約15 kb，含有9個(gè)開放閱讀框架，依次為5￠-NCR-ORF1a/1b-ORF2-GP3-GP4-GP5-M-N-NCR-3￠[15-16]。ORFla 編碼的寡聚蛋白pp1a經(jīng)加工后合成9個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，依次為 Nsp1α、Nsplβ、Nsp2～8[17]。其中，Nsp7 的氨基酸序列在型內(nèi)保守，同源性約90%，型間差異較大，同源性約50%[18-20]。同時(shí)，Nsp7具有較強(qiáng)的免疫原性，是PRRSV的血清學(xué)分型診斷技術(shù)研制的理想靶蛋白[21-23]。

國外研究學(xué)者通過體外重組表達(dá)全長的Nsp7蛋白，嘗試建立了美洲型和歐洲型PRRSV抗體分型檢測技術(shù)，但尚無臨床使用效果的評價(jià)[24-27]。本研究最初同樣選擇全長Nsp7編碼基因進(jìn)行了原核表達(dá)、純化和免疫印跡鑒定，結(jié)果表明，雖然重組Nsp7蛋白與同型的血清抗體具有較強(qiáng)的反應(yīng)活性，但與不同型的抗體也呈微弱的交叉免疫反應(yīng)，預(yù)示兩種蛋白存在有交叉抗原表位，難以實(shí)現(xiàn)兩種抗體的分型檢測。

生物學(xué)軟件分析Nsp7氨基酸序列，并對預(yù)測的抗原表位比對分析，表明 NA-Nsp7和EU-Nsp7兩種蛋白之間存在有兩個(gè)相似抗原表位。通過融合PCR，將相似抗原表位的編碼序列缺失后，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)和純化，獲得截短蛋白 NA-?Nsp7 和 EU-?Nsp7。NA-?Nsp7 和EU-?Nsp7分別與美洲型和歐洲型 PRRSV陽性血清有較強(qiáng)的特異性反應(yīng)，且無交叉免疫反應(yīng)，表明缺失相似抗原表位后不僅不會(huì)影響重組蛋白的免疫反應(yīng)性，而且顯著提高了反應(yīng)的特異性。在本研究中，重組蛋白 NA-?Nsp7和EU-?Nsp7兩種截短蛋白在大腸桿菌中均獲得了可溶性高效表達(dá)，蛋白易于純化，免疫反應(yīng)性強(qiáng)，適合大規(guī)模制備，為進(jìn)一步開發(fā)美洲型和歐洲型PRRSV分型診斷試劑奠定了基礎(chǔ)，對我國PRRS的防控具有重要意義。

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