竇京嬌，王 燕，孫 岳，林學(xué)政，姜 偉*

(1.山東輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353；2. 國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061；3. 國家海洋局 海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266061；4. 國家海洋局 海洋咨詢中心，北京 100860)

北極地區(qū)具有獨(dú)特的地理及氣候特征，除部分地區(qū)在短暫的夏季有冰雪融化外，其余均常年被冰雪覆蓋，且環(huán)境溫度在0～-50 ℃[1]。海冰是個半固體矩陣，冰晶間彌漫著大小不等、充滿鹵水的孔、道網(wǎng)絡(luò)，在海冰內(nèi)部形成了一個溫度、鹽度以及營養(yǎng)鹽濃度急劇變化地封閉或半封閉的微生境[2]。在海冰融化過程中，局部鹽度急劇降低(<10)，相反在海水結(jié)冰的過程中，由于鹽分被排斥在冰晶之外，形成鹽囊和鹽通道，造成其中的鹽度急劇上升(>150)。因此，海冰微生物不僅要經(jīng)受溫度的季節(jié)性變化，還要經(jīng)受鹽度的季節(jié)性變化[3-4]。盡管海冰環(huán)境特征具有強(qiáng)烈的負(fù)效應(yīng)，但生存于海冰中的微生物在長期的進(jìn)化過程中形成了一系列適應(yīng)該生境所需的復(fù)雜的生理和新陳代謝特征，形成了獨(dú)特的適應(yīng)機(jī)制。

對細(xì)胞的生存和生長來說，有功能的細(xì)胞膜是必不可少的。溫度降低對膜產(chǎn)生的影響首先表現(xiàn)為膜流動性的降低，并最終喪失功能，因此，保持低溫下膜的流動性是微生物耐冷機(jī)理中的重要方面，而脂肪酸的種類和組成是細(xì)胞維持膜流動性的決定性因素[5]。嗜冷菌可能具有在非常低的溫度下就可以發(fā)生相變的膜脂。許多微生物通過改變細(xì)胞膜的脂肪酸組成來保持其在低溫時的流動性。最常見的反應(yīng)是通過增加去飽和酶的活力提高脂雙層中不飽和脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；另一反應(yīng)是縮短脂肪酸?；湹拈L度、增加支鏈脂肪酸的比例或降低環(huán)狀脂肪酸的比例[6]。鹽度升高細(xì)菌受高滲透壓的影響，將破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，從而影響細(xì)菌的生理活動。在高鹽環(huán)境條件下，細(xì)胞為了維持正常的細(xì)胞形態(tài)和正常的生理功能必然會調(diào)動機(jī)體的生理生化反應(yīng)，以便加強(qiáng)細(xì)胞膜的完整性和流動性。程書梅等[7]研究發(fā)現(xiàn)在高鹽沖擊條件下，耐鹽突變株細(xì)胞膜的穩(wěn)定性明顯高于親株，由此推斷維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性也是菌株抵御高鹽沖擊的一個重要原因。

我們通過分析溫、鹽變化對北極海冰細(xì)菌脂肪酸組成及質(zhì)膜流動性的影響，將有助于人們對其低溫和高鹽適應(yīng)方式有進(jìn)一步的認(rèn)識，以期為北極海冰細(xì)菌的環(huán)境適應(yīng)機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，同時也為開發(fā)利用北極海冰細(xì)菌中的不飽和脂肪酸提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株

菌株a24-4,R03-1和R03-8取自中國第4次北極科學(xué)考察所采集的海冰樣品，采用Zobell 2216E培養(yǎng)基篩選分離獲得，16S rDNA鑒定結(jié)果表明3株菌均屬于假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonassp.)，為革蘭氏陰性菌。

1.2 主要儀器、試劑和培養(yǎng)基

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(7890A GC; 5975C MSD)、F-4500熒光分光光度計(日本島津)、低溫振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-F100)、脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)、1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)(Sigma公司)；甲醇、正己烷為色譜純；其余試劑均為分析純。

所使用培養(yǎng)基于1×105Pa下濕熱滅菌20 min，不同鹽度培養(yǎng)基的成分見表1。海水取自山東青島海域，鹽度約為30。

表1 培養(yǎng)基成分Table 1 Components of culture media

1.3 不同培養(yǎng)條件下菌株的培養(yǎng)

1)對照組：按2%接種量把菌株接種于鹽度為30培養(yǎng)基中，10 ℃， 150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h；

2)低溫培養(yǎng)：按2%接種量將菌株接種于鹽度為30的培養(yǎng)基中，0 ℃, 150 r/min低溫培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)144 h；

3)低溫脅迫：按對照組方法培養(yǎng)菌株24 h后移至0 ℃,150 r/min低溫振蕩培養(yǎng)48 h；

4)高鹽培養(yǎng)：按2%接種量將菌株接種于鹽度為90的培養(yǎng)基中，10 ℃,150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h；

5)高鹽脅迫：按對照組方法培養(yǎng)菌株24 h，菌體離心濃縮加入鹽度為90的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 細(xì)胞膜流動性測定

1)取一定量的菌懸液，4 000 r/min離心5 min；2)收集菌體，用PBS洗滌2次，并重懸于PBS緩沖液中，調(diào)整其數(shù)量約為108個/ mL；3)取2 mL菌液，加入4 mL濃度為2×10-6mol/ L的DPH，30 ℃溫育30 min，即得到DPH標(biāo)記的細(xì)胞膜。用帶有偏振裝置的熒光分光光度計測定并計算熒光偏振度[8]。檢測條件：溫度25 ℃，激發(fā)波長Ex=362 nm， 發(fā)射波長Em=432 nm,激發(fā)狹縫10 nm，發(fā)射狹縫10 nm。

熒光偏振度

(1)

(2)

式中IVV為起偏器和檢偏器光軸同為垂直方向時測得的熒光強(qiáng)度；IVH為起偏器和檢偏器光軸分別為垂直和水平方向時測得的熒光強(qiáng)度；G為光柵校正因子；IHV為起偏器和檢偏器光軸分別為水平和垂直方向時測得的熒光強(qiáng)度；IHH為起偏器和檢偏器光軸同為水平方向時測得的熒光強(qiáng)度。

1.5 細(xì)菌細(xì)胞膜脂肪酸組成的分析

細(xì)胞膜脂肪酸樣品處理：1)將培養(yǎng)好菌體置于-80 ℃冷凍干燥，然后置于10 mL螺口試管中，加入5 mL 0.4 mol / L 的KOH-CH3OH溶液，60 ℃下皂化1 h。2)冷卻后加入4 mL體積比為1∶9的HCl-CH3OH，60 ℃水浴20 min，冷卻。3)加入2 mL 3%NaCl溶液，用1 mL色譜純正己烷萃取甲酯化的脂肪酸[9]，萃取樣品利用GC-MS聯(lián)用儀進(jìn)行檢測。

色譜條件：DB-5MS毛細(xì)管柱(30 m×250 μm×0.25 μm膜厚，Agilent)，載氣為高純氦氣(99.999%)，流速1.0 mL / min，進(jìn)樣器溫度280 ℃，柱溫280 ℃，檢測溫度260 ℃，進(jìn)樣量1.0 μL。

質(zhì)譜條件：電離方式EI，電子能量 70 eV, 離子源溫度 230 ℃, 四極桿溫度150 ℃。

定量分析：采取面積歸一化法分析各脂肪酸組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

通過SPSS(Version 19.0，SPSS Inc.)軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度和鹽度對菌株生長的影響

將分離自海冰樣品的3株菌a24-4，R03-1和R03-8分別于不同溫度(0，5，10，15，20和25 ℃)和不同鹽度(0，30，60和90)條件下培養(yǎng)，觀察溫度和鹽度對菌株生長的影響，結(jié)果如圖1(圖中OD值為實(shí)測值×稀釋倍數(shù))。由圖1可知，當(dāng)培養(yǎng)基鹽度為0，溫度為0～20 ℃時菌體均不生長。而當(dāng)培養(yǎng)溫度為25 ℃時，菌株有生長現(xiàn)象，OD值約1.0，在鹽度為0時3株菌出現(xiàn)了不同的生長情況，推測可能由于菌株a24-4與R03-1、R03-8對鹽度的需求不盡相同造成的。培養(yǎng)基鹽度為30，60和90時，菌體均在培養(yǎng)溫度為10 ℃達(dá)到最大生長量；在培養(yǎng)溫度為0，5和10 ℃時，培養(yǎng)基鹽度為30時，菌體OD值最大，而溫度為15，20和25 ℃時，菌株在鹽度為60時OD值最大。與a24-4生長情況不同，R03-1和R03-8在鹽度為0時各個培養(yǎng)溫度下均不生長，但均在培養(yǎng)溫度為10 ℃，培養(yǎng)基鹽度為30時達(dá)到最大量。因此3株菌均為嗜冷耐鹽菌，最適生長溫度和鹽度分別為10 ℃和30。

2.2 溫度對細(xì)胞膜流動性和脂肪酸組成的影響

2.2.1 溫度對細(xì)胞膜流動性的影響

溫度對細(xì)胞膜流動性的影響結(jié)果如表2所示。溫度影響細(xì)胞膜的流動性，溫度越高，分子的能量越大，分子運(yùn)動速度加快，膜脂的活動性就越大，熒光探針易于進(jìn)入類脂雙層而標(biāo)記上。如果膜脂質(zhì)烴鏈活動性很大，則DPH分子從吸收到發(fā)射隨磷脂分子的活動而有不同程度的傾斜或轉(zhuǎn)動，以致發(fā)射的熒光偏振度減少，即膜脂流動性增大；反之，如果脂質(zhì)烴鏈活動性小，則DPH分子從吸收到發(fā)射在磷脂分子中排列整齊，發(fā)射的熒光偏振度值大，則膜脂的流動性小，熒光偏振度與膜流動性成反比。由表2知，菌株a24-4在低溫脅迫和低溫培養(yǎng)時細(xì)胞膜的熒光偏振度分別從0.253升高到0.258和0.265，與對照組相比差異不顯著(P>0.05)；與此相同，菌株R03-8和R03-1在低溫下和低溫脅迫時熒光偏振度與對照組相比變化也不大(P>0.05)，表明低溫下細(xì)胞質(zhì)膜維持著正常的流動性。這與JAGANNADHAM等研究發(fā)現(xiàn)南極細(xì)菌Sphingobacteriumantarcticus生長在5 ℃環(huán)境下與生長在25 ℃環(huán)境下的膜流動性基本相同[10]的結(jié)果一致。

圖1 不同溫度和鹽度對菌株生長的影響Fig.1 Effect of different temperature and salinity on the growth of strains

表2 溫度對細(xì)菌細(xì)胞膜熒光偏振度(P)的影響Table 2 Effect of temperature on the fluorescence polarization(P) of bacteria cell memrane

2.2.2 溫度對脂肪酸組成的影響

由表3可知，3株菌均能夠合成多種脂肪酸，包括直鏈飽和脂肪酸(C16∶0,C18∶0)和其他一些低熔點(diǎn)脂肪酸，如單不飽和脂肪酸(C16∶1,C18∶1)、支鏈脂肪酸(14-Me, C15∶0；15-Me, C16∶0)和環(huán)甲基脂肪酸(順-9,10環(huán)甲基十七烷酸、順-9,10-甲基十九烷酸)。與對照組相比，低溫脅迫和低溫培養(yǎng)時3株菌質(zhì)膜脂肪酸組成和質(zhì)量分?jǐn)?shù)均發(fā)生了變化：1)3株菌質(zhì)膜總單不飽和脂肪酸(UFAs)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均明顯升高，在單不飽和脂肪酸中，C15∶1和C17∶1質(zhì)量分?jǐn)?shù)表現(xiàn)為降低，C16∶1和C18∶1質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，以C16∶1質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化最為顯著，對照組膜脂肪酸組成中C16∶1質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到40%左右，而低溫培養(yǎng)時其質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)60%以上；2)3株菌株在低溫脅迫和低溫培養(yǎng)時支鏈脂肪酸(BCFAs)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均明顯升高，會出現(xiàn)甲基分支和甲基異構(gòu)分支現(xiàn)象，如15-Me, C16∶1、14-Me, C16∶0，同時還會產(chǎn)生環(huán)甲基分支結(jié)構(gòu)，如Cis-9,10-Me, C16∶0和Cis-9,10-Me, C18∶0。由此可見，3株菌通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜脂肪酸不飽和度和支鏈化程度來適應(yīng)低溫環(huán)境；由各單不飽和脂肪酸的變化趨勢可知C16∶1可能對維持細(xì)胞膜流動性起著關(guān)鍵作用，而C15∶1和C17∶1兩種脂肪酸對菌株的低溫生長是非必需的。綜上所述，在冷適應(yīng)條件下，3株菌均通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜脂肪酸不飽和度和支鏈化程度來降低熔點(diǎn)，進(jìn)而增強(qiáng)菌株對冷的耐受力。

表3 溫度對脂肪酸組成影響(質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%)Table 3 Effect of temperature on the fatty acid composition(mass fraction/%)

注：“-”代表未發(fā)現(xiàn)

2.3 鹽度對細(xì)胞膜流動性和脂肪酸組成的影響

2.3.1 鹽度對細(xì)胞膜流動性的影響

由表4知，3株菌在高鹽脅迫和高鹽環(huán)境下生長時，熒光偏振度增大，細(xì)胞膜流動性均有所降低，但無顯著性變化(P>0.05)?？赡苡捎诰瓯旧頌槟望}菌，在高鹽條件下為適應(yīng)環(huán)境，其可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜組分維持一定的細(xì)胞膜流動性，來抵御高鹽沖擊。

表4鹽度對細(xì)菌細(xì)胞膜熒光偏振度(P)的影響

Table 4 Effect of salinity on the fluorescence polarization(P) of bacteria cell membrane

項(xiàng) 目菌 株a24-4R03-1R03-8對照組0.253±0.0040.272±0.0030.191±0.007高溫脅迫0.268±0.0050.279±0.0050.216±0.009高鹽培養(yǎng)0.263±0.0090.277±0.0050.212±0.004

2.3.2 鹽度對脂肪酸組成的影響

由表5知，高鹽培養(yǎng)時3株菌支鏈脂肪酸比例均顯著升高。因此，在對高鹽的適應(yīng)過程中，支鏈脂肪酸的增加起重要作用：高鹽條件下，此3株菌通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜中支鏈脂肪酸的組成來維持細(xì)胞膜流動性，進(jìn)而抵御高鹽沖擊，減少高鹽對質(zhì)膜的損傷。從不飽和脂肪酸組成來看，3株菌的變化趨勢不盡相同，而 C16∶1在3株菌中質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著升高，由此推測，C16∶1可能在高鹽環(huán)境下也是維持細(xì)胞正常生長的一個關(guān)鍵因素。

表5 鹽度對脂肪酸組成影響(質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%)Table 5 Effect of salinity on fatty acid composition(mass fraction/%)

注：“-”代表未發(fā)現(xiàn)

3 討 論

極地生態(tài)系統(tǒng)的獨(dú)特性為研究惡劣條件下微生物的適應(yīng)機(jī)制提供了極好的資源。細(xì)菌Pseudoalteromonassp.a24-4,Pseudoalteromonassp.R03-1和Pseudoalteromonassp.R03-8分離自北極海冰樣品。低溫下3株菌質(zhì)膜均能維持正常流動性，膜不飽和脂肪酸和支鏈脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，說明菌株在低溫環(huán)境下通過調(diào)整質(zhì)膜脂肪酸不飽和度和支鏈化程度來增加膜的流動性，增強(qiáng)菌株對冷的耐受力。這與Sofia等[11]，F(xiàn)ernandez等[12]，Wang等[13]和Chiar等[14]的研究結(jié)果一致。

低溫可以減慢大多數(shù)的生理進(jìn)程，降低膜的流動性，會導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜上脂肪酸鏈更緊密的排列，使脂雙層凝膠化，從而限制了分子的運(yùn)動，影響膜的功能。因此，維持最佳的膜流動性就成為微生物在低溫下生存的關(guān)鍵，而脂肪酸的種類和組成是細(xì)胞維持膜流動性的決定性因素。

對南極細(xì)菌外的其它冷適應(yīng)性細(xì)菌的研究初步揭示了這些微生物為維持細(xì)胞質(zhì)膜正常的流動性而采取的幾種策略。首先，通過冷誘導(dǎo)去飽和，使飽和脂肪酸轉(zhuǎn)變成不飽和脂肪酸的策略是非常普遍的，并且不飽和脂肪酸對膜的流動性影響顯著；其次，通過降低脂肪酸鏈的長度和合成支鏈脂肪酸來保持膜最佳流動性[15]。低溫下，質(zhì)膜中脂肪酸的代謝發(fā)生了顯著變化，包括雙鍵的引入、脂肪酸鏈長度的降低和改變組成成分等，從而降低了膜的相變溫度，保持在低溫條件下的生物學(xué)功能[16]。李博等[17]研究發(fā)現(xiàn)，低溫下革蘭氏陽性菌主要利用分支脂肪酸來調(diào)整膜的流動性；而革蘭氏陰性菌則呈現(xiàn)較為多樣的適冷機(jī)制，10%以下革蘭氏陰性細(xì)菌以支鏈飽和脂肪酸為主要膜脂調(diào)整方式，絕大多數(shù)陰性菌以不飽和直鏈或不飽和支鏈脂肪酸為主要形式存在，即主要以不飽和鍵的形式來調(diào)整膜脂在低溫環(huán)境下的流動性。

在高鹽環(huán)境下，細(xì)胞通過細(xì)胞膜的被動應(yīng)答和細(xì)胞內(nèi)的主動調(diào)控，相應(yīng)調(diào)整細(xì)胞膜的物理特性，進(jìn)而抵御其對細(xì)胞造成的傷害。本研究表明：菌體通過調(diào)節(jié)質(zhì)膜中支鏈脂肪酸的組成來增加對高鹽的抗性，顯示菌體通過這種積極的反應(yīng)保護(hù)細(xì)胞，從而維持質(zhì)膜的正常流動性。

目前關(guān)于鹽度對脂肪酸組成的研究報道很少，僅發(fā)現(xiàn)Xu等[18]對Dunaliellasp.高鹽適應(yīng)性的研究報道，文中指出總飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著鹽度的增加而升高，多不飽和脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著鹽度的升高而降低，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此不太一致，僅R03-1質(zhì)膜總不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨鹽度升高而升高，而a24-4和R03-8質(zhì)量分?jǐn)?shù)卻略有降低。但是C16∶1質(zhì)量分?jǐn)?shù)表現(xiàn)出明顯增加的趨勢，這與低溫培養(yǎng)時，3株菌中C16∶1質(zhì)量分?jǐn)?shù)也明顯增高結(jié)果一致。由此推測，C16∶1可能是北極海冰細(xì)菌環(huán)境適應(yīng)過程中質(zhì)膜脂肪酸組成中的必需脂肪酸，但有關(guān)C16∶1在適應(yīng)極端環(huán)境中的地位及其作用機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

總之，在低溫和高鹽環(huán)境條件下，北極海冰細(xì)菌通過脂肪酸組成的變化保護(hù)膜正常流動，從而維持細(xì)胞正常功能，這是北極海冰細(xì)菌適應(yīng)極端環(huán)境的一種機(jī)制。

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