李淑芳，邱德全，張繼東*，楊世平，賈春紅，邱明生

(1.廣東海洋大學動物醫(yī)學系，廣東 湛江 524088；廣東海洋大學水產(chǎn)學院，廣東 湛江 524088)

東風螺(Babyloniaareolata)屬軟體動物腹足綱、蛾螺科、東風螺屬。我國的主要養(yǎng)殖品種有方斑東風螺(Babyloniaareolata)、泥東風螺(Babylonialutosa)和臺灣東風螺(Babyloniaformosae)三種。2000年以來，東風螺在我國廣東、海南、福建等南海地區(qū)已實現(xiàn)人工規(guī)?；B(yǎng)殖。目前，對東風螺規(guī)模化養(yǎng)殖危害嚴重的主要疾病為脫殼病和吻腫病。東風螺脫殼病在我國首次發(fā)生于2002年，且在2004年出現(xiàn)較大規(guī)模暴發(fā)，至今在東風螺養(yǎng)殖場時有發(fā)生，發(fā)病率可高達80%以上，具有傳染性和復發(fā)性[1]。為探討東風螺脫殼病和吻腫病與條件致病菌的相關性，從2011年開始，本課題組對廣東省湛江市某大型東風螺規(guī)?；B(yǎng)殖場發(fā)病螺池和未發(fā)病螺池的水樣進行了異養(yǎng)菌菌落總數(shù)檢測，并對脫殼病和吻腫病病螺以及健康螺進行了條件致病菌的分離與鑒定，以期找出東風螺脫殼病、吻腫病與致病菌及條件致病菌感染的相關關系，為東風螺疾病的病因?qū)W研究和防治技術(shù)研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集

2011年，湛江市某東風螺養(yǎng)殖場(循環(huán)水養(yǎng)殖)，方斑東風螺發(fā)生脫殼病，同場養(yǎng)殖的泥東風螺發(fā)生脫殼病和吻腫病混合感染。選擇脫殼病方斑東風螺養(yǎng)殖池、脫殼病-吻腫病混合感染的泥東風螺養(yǎng)殖池和未發(fā)病的方斑東風螺養(yǎng)殖池各1個，每池采集水樣各200 mL。從脫殼病方斑東風螺池選取5只脫殼后健活的軟體螺，從脫殼病-吻腫病混合感染螺池選取5只吻腫病螺，從未發(fā)病方斑東風螺螺池選擇臨床健康螺5只，分別放入盛有適量原池水的滅菌三角瓶備檢。

1.1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

MightyAmp?DNA Polymerase 試劑盒及 DNA Marker，購自Takara 公司大連分公司；細菌16S rDNA鑒定通用引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司廣州分公司合成?？片敿位【@色培養(yǎng)基，購于上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司；TCBS培養(yǎng)基，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；弧菌科細菌生化鑒定管，購于浙江天和微生物試劑有限公司；5%兔血瓊脂平板，由本試驗室自行制備。

1.1.3 主要儀器

PCR儀，Biometra Tg PCR；DYY-8C型電泳儀，北京六一儀器廠；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 水體異養(yǎng)菌菌落總數(shù)測定

采用常規(guī)平皿傾注計數(shù)法，測定發(fā)病池和未發(fā)病池內(nèi)異養(yǎng)菌的菌落總數(shù)。培養(yǎng)溫度35 ℃，培養(yǎng)時間48 h。

1.2.2 條件致病菌的分離

將脫殼病病螺軟體、帶殼吻腫病病螺及健康螺樣品用滅菌生理鹽水沖洗，采用無菌鉗破碎螺殼，取出完整軟體，分別用滅菌生理鹽水沖洗3遍后，用滅菌手術(shù)剪剪斷螺的足部肌肉，將新鮮斷面涂布接種于5%兔血瓊脂平板，并用滅菌接種環(huán)蘸取螺生殖腺內(nèi)容物劃線接種于另一兔血瓊脂平板。35 ℃培養(yǎng)18～24 h。

1.2.3 TCBS培養(yǎng)基和科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)

從上述兔血瓊脂平板上挑選溶血和不溶血的單個菌落，每板挑選3～5個菌落，分別劃線接種于3.5%NaCl營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(pH6.8)進行純化培養(yǎng)。然后，從營養(yǎng)瓊脂平板上分別轉(zhuǎn)接至TCBS培養(yǎng)基和科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基，35 ℃培養(yǎng)18～24 h。根據(jù)細菌在不同培養(yǎng)基上的生長特性和菌落特征，初步判定細菌種類。

1.2.4 16S rDNA PCR擴增與序列分析

將上述試驗分離得到的菌株，用其18 h的新鮮培養(yǎng)菌落，進行16S rDNA PCR擴增與序列分析。

1.2.4.1 引物設計與合成

根據(jù)E.coli16S rDNA基因序列保守區(qū)域設計兩段引物(16SF:5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG AAC GCT-3′；16SR:5′-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT TCA CCC C-3′)，由上海英駿生物技術(shù)有限公司廣州分公司合成。

1.2.4.2 16S rDNA擴增與瓊脂糖凝膠電泳

將分離菌株分別劃線接種于3.5%NaCl營養(yǎng)瓊脂(pH7.8)，35 ℃培養(yǎng)18 h，用于16S rDNA擴增。

根據(jù)TaKaRa公司產(chǎn)品MightyAmp?DNA Poiymerase Ver.2使用說明，用菌落PCR方法進行擴增。反應體系包括2×MightyAmp buffer25 μL，Primer 1和Primer 2各15 pmol， MightyAmp DNA Polymerase 1 μL(0.025 U/μL)，加ddH2O至50 μL。

PCR反應程序為：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸90 s，進行40個循環(huán)；68 ℃延伸90 s; 4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.4.3 16S rDNA PCR產(chǎn)物測序

將16S rDNA擴增反應體系與引物一同系送上海英駿生物技術(shù)有限公司廣州分公司測序部測序。

1.2.5 生化反應試驗

將分離菌株的新鮮固體培養(yǎng)物，分別接種于葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘露糖、肌醇、VP試驗、蛋白胨水、賴氨酸、精氨酸、0%NaCl胨水、3%NaCl胨水、6%NaCl胨水、8%NaCl胨水、10% NaCl胨水等生化反應試驗管，35 ℃培養(yǎng)，按規(guī)定時間觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 水體菌落總數(shù)測定

水體異養(yǎng)菌菌落總數(shù)檢測結(jié)果顯示，未發(fā)病方斑東風螺螺池水體異養(yǎng)菌菌落總數(shù)為7.6×104cfu/mL，脫殼病方斑東風螺螺池水體異養(yǎng)菌菌落總數(shù)為1.34×106cfu/mL，泥東風螺脫殼病-吻腫病螺池水體異養(yǎng)菌菌落總數(shù)為1.46×107cfu/mL。由檢測結(jié)果可見，發(fā)病東風螺池內(nèi)異養(yǎng)菌數(shù)量明顯高于未發(fā)病池內(nèi)異養(yǎng)菌數(shù)量。

2.2 細菌分離鑒定

用兔血瓊脂平板從2種發(fā)病東風螺、健康東風螺體內(nèi)共分離到131株細菌，該131株細菌在TCBS培養(yǎng)基和科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基上均能生長。根據(jù)細菌在TCBS培養(yǎng)基和弧菌顯色培養(yǎng)基上的生長特性，結(jié)合生化試驗和16S rDNA序列分析，共110株細菌得到鑒定，結(jié)果如下：脫殼病方斑東風螺樣品分離得到37株細菌，鑒定結(jié)果為副溶血弧菌10株、哈氏弧菌17株、創(chuàng)傷弧菌2株、河流弧菌2株、Vibriohepatarius2株、腐敗希瓦氏菌1株、海藻希瓦氏菌2株、芽孢桿菌1株，其中優(yōu)勢菌株為哈氏弧菌和副溶血弧菌(溶血菌株)；吻腫病泥東風螺樣品分離得到33株細菌，分別是副溶血弧菌3株、哈氏弧菌7株、鮑魚希瓦氏菌9株、海藻希瓦氏菌12株、芽孢桿菌2株，其中優(yōu)勢菌株為海藻希瓦氏菌、鮑魚希瓦氏菌和哈氏弧菌；健康方斑東風螺樣品分離得到40株細菌，分別是副溶血弧菌26株、創(chuàng)傷弧菌1株、Vibriohepatarius10株、海藻希瓦氏菌1株、美人魚發(fā)光桿菌2株，其中優(yōu)勢菌株為副溶血弧菌(非溶血菌株)和Vibriohepatarius。其余21株細菌因測序失敗和生化反應不確定，未能作出鑒定。各類試驗樣品中細菌種類及溶血菌株的分布情況見表1。

表1東風螺體內(nèi)條件致病菌分離鑒定結(jié)果(株)Table 1 The Isolated and Identified Results of the conditional pathogenic bacteria in abylonia areolate (strains)

注：a:脫殼病螺樣品分離的3株希瓦氏菌包括:腐敗希瓦氏菌1株，海藻希瓦氏菌2株；b:吻腫病螺樣品分離的21株希瓦氏菌包括：鮑魚希瓦氏菌9株、海藻希瓦氏菌12株；c:健康螺樣品分離的1株希瓦氏菌為海藻希瓦氏菌

2.3 16S rDNA序列分析

分離菌株的16S rDNA擴增產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，均擴增出1 490 bp的基因片段，其16S rDNA測序結(jié)果，通過NCBI的Blast程序(http:∥blast.ncbi.nih.gov/blast)進行核苷酸序列比對分析，結(jié)果表明，有共39株細菌與副溶血性弧菌ATCC 1782菌株(GenBank序列注冊號為NR 041838)同源性100%，24株細菌與哈氏弧菌NCIMB 1 280菌株(GenBank 序列注冊號為NR 043165)同源性100%，3株細菌與創(chuàng)傷弧菌324號菌株(GenBank序列注冊號為NR 036888)同源性99%，2株細菌與河流弧菌VL 5125菌株(GenBank序列注冊號為NR 036790)同源性98%，12株細菌與Vibriohepatarius與LMG 20362菌株(GenBank序列注冊號為NR 025491)同源性為100%，1株細菌與腐敗希瓦氏菌LMG 26268菌株(GenBank序列注冊號別為NR 044863)同源性100%，15株細菌與海藻希瓦氏菌同源性OK-1菌株(GenBank序列注冊號NR028673)同源性99%，9株細菌與鮑魚希瓦氏菌DW.1菌株(GenBank序列注冊號為NR 044134)同源性99%，另有3株細菌與aerius芽胞桿菌 NBRC15535菌株(GenBank序列注冊號為NR 041455)同源性100%，2株與美人魚發(fā)光桿菌與ATCC 33539菌株(GenBank序列注冊號為NR 040831)同源性100%。其他菌株因測序失敗沒有進行分類。

131株分離菌株經(jīng)16S rDNA序列分析，共鑒定出弧菌屬細菌5種，希瓦氏菌屬細菌3種,芽胞桿菌屬細菌1種和美人魚發(fā)光桿菌1種。各類細菌在不同試驗樣品中的分布見表1。

2.4 溶血特性及生化反應特性

分離菌株在兔血瓊脂平板上的生長情況顯示，脫殼病方斑東風螺體內(nèi)分離的副溶血弧菌多數(shù)菌株對兔紅細胞具有溶血活性(8/10)，健康螺螺體內(nèi)分離的副溶血弧菌僅有少數(shù)菌株具有溶血活性(4/26)。脫殼病和吻腫病病螺體內(nèi)分離的哈氏弧菌僅有少數(shù)菌株具有溶血活性(5/24)，且溶血菌株在兔血瓊脂平板上形成狹窄的透明溶血環(huán)。Vibriohepatarius多沒有溶血活性，創(chuàng)傷弧菌、河流弧菌、所有希瓦氏菌、芽胞桿菌、美人魚發(fā)光桿菌均呈完全溶血，詳見表2。

除芽胞桿菌和美人魚發(fā)光桿菌外，其余菌株的生化反應試驗結(jié)果表明，分離到的副溶血弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、河流弧菌的生化反應特性與資料記載相符[2]。希瓦氏菌生化反應結(jié)果顯示，有3種生化反應類型，分別為腐敗希瓦氏菌、海藻希瓦氏菌和鮑魚希瓦氏菌，結(jié)果詳見表2。

表2 分離細菌的生化反應特性Table 2 Biochemical characteristics of isolated bacteria

注：“+/-”表示產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；“-/-” 表示不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣； “±”表示多數(shù)菌株試驗陽性，少數(shù)陰性；“-/+”表示多數(shù)菌株試驗陰性，少數(shù)陽性

3 討 論

3.1 脫殼病和吻腫病東風螺體內(nèi)細菌菌相分析

本試驗從脫殼病和吻腫病病螺及健康螺體內(nèi)分離到的細菌多為條件致病菌，脫殼病和吻腫病病螺樣品以及健康螺樣品中細菌種類各不相同，而且各類試驗螺樣品中，各自的優(yōu)勢菌株種類也存在較大差異。脫殼病方斑東風螺體內(nèi)分離出8種細菌，優(yōu)勢菌株為副溶血弧菌(溶血菌株)和哈氏弧菌；吻腫病泥東風螺體內(nèi)分離出4種細菌，優(yōu)勢菌株為海藻希瓦氏菌、鮑魚希瓦氏菌和哈氏弧菌；健康方斑東風螺體分離出5種細菌，優(yōu)勢菌株為副溶血弧菌(非溶血菌株)和Vibriohepatarius。哈氏弧菌、河流弧菌、海藻希瓦氏菌、鮑魚希瓦氏菌僅分離于病螺體內(nèi)，副溶血弧菌同時存在于病螺和健康螺體內(nèi)，健康螺體內(nèi)副溶血弧菌數(shù)量雖然多于病螺體內(nèi)的數(shù)量，但病螺體內(nèi)副溶血弧菌以能夠溶解兔紅細胞的溶血性菌株占多數(shù)(9/13)，健康螺體內(nèi)副溶血弧菌的溶血菌株較少(4/26)，因此認為，副溶血弧菌(溶血菌株)、哈氏弧菌、河流弧菌、鮑魚希瓦氏菌和海藻希瓦氏菌可能與東風螺脫殼病與吻腫病有關。哈氏弧菌是存在于兩種病螺體內(nèi)的共同優(yōu)勢菌株，可能在疾病發(fā)生發(fā)展過程中是主要致病性細菌。

3.2 東風螺脫殼病和吻腫病病因分析

東風螺脫殼病的病因至今尚不清楚，楊章武等[3]通過試驗將正在發(fā)生脫殼病的東風螺與健康螺養(yǎng)在同一個水池混合飼養(yǎng)，觀察17～40 d后，健康螺生長、攝食、存活基本正常，未出現(xiàn)感染脫殼病的癥狀。王國福等[1]利用抗菌藥物對方斑東風螺脫殼病進行治療試驗，結(jié)果表明土霉素、新諾明等多種抗生素對脫殼病無明顯治療效果。關于東風螺吻腫病發(fā)病原因的報道不多，2009年黃郁蔥等[4]從吻腫病方斑東風螺體內(nèi)分離到一株哈氏弧菌，經(jīng)肌肉注射和浸浴法人工感染健康東風螺均獲得成功，分離菌株對東風螺的LD50值為6.8×105cfu/g，證明哈氏弧菌能引發(fā)方斑東風螺吻管水腫病。本試驗結(jié)果顯示，脫殼病和吻腫病東風螺養(yǎng)殖水體中異養(yǎng)菌數(shù)量顯著高于健康螺養(yǎng)殖水體中細菌的數(shù)量，且兩種病螺體內(nèi)致病菌和條件致病菌的種類和數(shù)量與健康螺體內(nèi)的存在較大差異，表明東風螺脫殼病和吻腫病的發(fā)生、發(fā)展與水體環(huán)境中異養(yǎng)菌的數(shù)量及體內(nèi)條件致病菌的感染程度具有密切關系,其原因:一方面,由于水體環(huán)境異養(yǎng)菌數(shù)量的增加，水體環(huán)境正常微生物區(qū)系平衡破壞，致使致病菌和條件致病菌大量繁殖，而引起東風螺發(fā)病或加重病情發(fā)展；另一方面，由于氣候改變、飼料轉(zhuǎn)換等其他原因誘發(fā)東風螺發(fā)病，導致病螺代謝產(chǎn)物在水體積累引起環(huán)境中異養(yǎng)菌數(shù)量增加，體內(nèi)條件致病菌的大量繁殖，加重病情發(fā)展，引起發(fā)病率和死亡率的增高。在本試驗中，哈氏弧菌作為脫殼病和吻腫病病螺體內(nèi)共同的優(yōu)勢菌株，可能與脫殼病和吻腫病發(fā)生有關。

溶血素被認為是致病性弧菌中分布最廣泛的毒素之一[5-8]，本試驗利用兔血瓊脂平板從試驗螺體內(nèi)分離致病性細菌，兩種病螺體內(nèi)分離到的副溶血弧菌多數(shù)菌株、河流弧菌、創(chuàng)傷弧菌、希瓦氏菌均具有較強的溶血活性。但是，從脫殼病和吻腫病病螺分離到的哈氏弧菌多數(shù)菌株在兔血瓊脂平板上卻沒有溶血活性，僅有少數(shù)菌株在兔血瓊脂平板上形成狹窄的β溶血環(huán)。哈氏弧菌含有熱不穩(wěn)定性溶血素TLH，不含熱穩(wěn)定性溶血素TDH[5]，其溶血素的主要致病作用機理為破壞紅細胞，釋放出血紅素以及結(jié)合鐵成分，鐵濃度高時能催化形成致死性的羥自由基，對細胞具有很強毒害作用[9]。Zhang 等[6-7]研究發(fā)現(xiàn)致病性哈氏弧菌VIB645 胞外產(chǎn)物對大西洋鮭和虹鱒的紅細胞具有高滴度(1:32)的溶血活性，而且胞外產(chǎn)物對兔紅細胞的溶血活性比對綿羊、馬及驢的紅細胞的溶血作用更強，并認為該哈氏弧菌胞外產(chǎn)物的溶血活性在鮭科魚類的發(fā)病中起重要作用。但是，王斌等[10-11]研究證明，哈氏弧菌分泌的胞外酶含量和活性高低與細菌培養(yǎng)溫度關系不大，而與培養(yǎng)時間有一定關系，哈氏弧菌在35 ℃培養(yǎng)36 h時分泌的胞外酶含量和活性最高。因此，本試驗分離所得哈氏弧菌致病因子及其致病機理有待進一步深入研究。

海藻希瓦氏菌和鮑魚希瓦氏菌是脫殼病-吻腫病共患泥東風螺的主要優(yōu)勢菌，在脫殼病病螺體內(nèi)也分離到海藻希瓦氏菌，但不是優(yōu)勢菌株，海藻希瓦氏菌是否與吻腫病發(fā)生有關還有待深入研究。海藻希瓦氏菌能夠分泌河豚毒素[12]，是能夠感染人的一種條件有致病性細菌[13]。鮑魚希瓦氏菌的生物學特性及其致病性目前尚未見報道。

東風螺脫殼病和吻腫病的病因與發(fā)病機制雖然至今不明，但本試驗通過分析病螺體內(nèi)致病菌及條件致病菌的菌相，證明環(huán)境中及體內(nèi)致病菌及條件致病菌對脫殼病和吻腫病的發(fā)生、發(fā)展具有一定影響。因此，在脫殼病與吻腫病防治過程中，應重視和加強養(yǎng)殖環(huán)境中異養(yǎng)菌數(shù)量及條件致病菌的檢測與控制。本試驗分離到致病菌及條件致病菌對東風螺脫殼病和吻腫病的致病作用及機理，有待后續(xù)動物感染試驗及相關試驗進一步深入研究。

參考文獻(References)：

[1] WANG G F, ZHANG R Z, ZENG L M, et al. The method of prevention and treatmeat of shell-flesh seperating disease ofBabyloniaareolate[J]. Hebei Fishery，2008，176：37-40. 王國福，張瑞姿，曾令明，等. 方斑東風螺肉殼分離病的防治方法[J]. 河北漁業(yè)，2008，176：37-40.

[2] FANG H, CHEN C Z, ZHANG X J. Aquacultural animal pathogenic bacteriology [M].Beijing: China Agriculture Press, 2010：313-350. 房海，陳翠珍，張曉君.水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病原細菌學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社, 2010：313-350.

[3] YANG Z W, ZHANG Y B. The contacting infected testing of the shelling disease of Babylonia[J]. Journal of Aquaculture, 2010，3l(9)：1-3. 楊章武，張揚波.東風螺脫殼病活體接觸感染試驗[J]. 水產(chǎn)養(yǎng)殖，2010，3l(9)：1-3.

[4] HUANG Y C, JIAN J C, WU Z H, et al. Preliminary study on the pathogenic bacteria isolated from proboscis edema-diseasedBabyloniaareolata[J]. Fishery modernization , 2009，36(4)：37-41. 黃郁蔥，簡紀常，吳灶和，等.方斑東風螺吻管水腫病病原菌的初步研究[J]. 漁業(yè)現(xiàn)代化，2009，36(4)：37-41.

[5] WANG S X, ZHANG X H, SUN B G，et al. Distribution of five kinds of haemolysin genes in different vibrios and their correlation with activities of haemolytic and phospholipase [J].Journal of Fishery Sciences of China，2007，14(4)：570-577. 王淑嫻，張曉華，孫鉑光，等.不同海洋弧菌中5類溶血素基因的分布及其與溶血活性和磷脂酶活性的相關[J]. 中國水產(chǎn)科學，2007，14(4)：570-577.

[6] ZHONG Y B，ZHANG X H，CHEN J X，et al. Overexpression，purification，characterization and pathogenicity ofVibrioharveyihemolysin VHH [J].Infection and Immunity，2006，74(10)：6001-6005.

[7] ZHANG X H，MEADEN P G，AUSTIN B D. Duplication of hemolysin genes in a virulent isolate ofVibrioharveyi[J]. Applied Environment Microbiology，2001，67(7)：3161-3167.

[8] ZHANG X H，AUSTIN B. Haemolysins inVibriospecies[J]. Applied Microbiology，2005，98：1009-1011.

[9] ZHONG Y B, ZHANG X H, CHEN J X, et al. Expression ofVibrioharveyihemolysin gene vhhA inE.coliand its biological activities [J].Periodical of Ocean University of China, 2007, 37(1):97-102. 鐘英斌，張曉華，陳吉祥，等. 哈氏弧菌溶血素基因vhhA 在大腸桿菌中的表達及活性研究[J]. 中國海洋大學學報，2007，37(1)：97-102.

[10] WANG B, YU L P, HU L, et al. Isolation and identification of bacteriosis pathogen from culturedFuguobscuruswith canker of skin [J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2008，15(2)：352-358. 王斌，于蘭萍，胡亮，等. 紅鰭東方鲀皮膚潰爛病病原菌的分離與鑒定[J]. 中國水產(chǎn)科學，2008，15(2)：352-358.

[11] WANG B, YU L P, YUAN T, et al. Pathogenicity of extracellular products ofVibrioharveyito Fugu obscurus[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2010，17(1)：188-96. 王斌，于蘭萍，袁甜，等.哈氏弧菌胞外產(chǎn)物對紅鰭東方鲀的致病性[J]. 中國水產(chǎn)科學，2010，17(1)：188-96.

[12] YUE T F. Purification and determination ofShewanellaalgafermentated producing tetrodotoxin [D]. Qing dao: Ocean University of China，2008:1-4.岳田芳.海藻希瓦氏菌發(fā)酵產(chǎn)生河豚毒素的提取與檢測[D]. 青島：中國海洋大學，2008：1-4.

[13] YANG J C, GUO H, XU J J, et al. Studay on biological characteristics ofShewanella[J].Chinese Journal of Zoonoses, 2009,25(7):699-700. 楊晉川，郭惠，許靜靜，等. 希瓦菌生物學特性的實驗研究[J]. 中國人獸共患病學報，2009，25(7)：699-700.