柳學(xué)周, 徐永江, 陳學(xué)周, 劉之亮,2, 王妍妍, 李春廣,2

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室, 山東 青島 266071;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點實驗室，山東 青島 266071;3.全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，北京 100125)

近年來，隨著人類活動的日益頻繁和臨港工業(yè)的快速發(fā)展等問題不斷出現(xiàn)，導(dǎo)致了環(huán)境污染的加劇，致使我國近海海洋生物資源不斷衰退，開展人工增殖放流成為修復(fù)漁業(yè)資源最有效的方式，其中對放流生物的標(biāo)志技術(shù)成為對放流生物進行追蹤、回捕和效果評估的重要依據(jù)。自19世紀(jì)80年代以來，有學(xué)者采用標(biāo)記魚的方法估算封閉水體中魚類種群的大小和死亡率，標(biāo)志放流技術(shù)開始慢慢發(fā)展起來。在諸多標(biāo)志方法中，體外標(biāo)志因易操作、易識別和成本低廉而廣為應(yīng)用，其中T型標(biāo)志牌為使用較為廣泛的一種體外標(biāo)志[1]，且標(biāo)志牌一般不易脫落，保持率高，保留時間長，能區(qū)分不同的個體，有易被發(fā)現(xiàn)及回收簡便等優(yōu)點[2-3]，適宜于長期的標(biāo)記追蹤試驗研究。國外開展的海水魚類體外掛牌標(biāo)志放流技術(shù)研究較多，如金頭鯛(Sparusaurata)[4]、鮭魚(Salmosalar)[5]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[6]、歐洲無須鱈(Merlucciusmerluccius)[7]等。我國自上世紀(jì)90年代以來也相繼開展了多種魚類的標(biāo)志放流技術(shù)研究，如大黃魚(Pseudosciaenacrocea)[8-9]、牙鲆[10]、鮸魚(Miichthysmiiuy)[11]的標(biāo)志放流等，取得了一定的進展，為這些魚類的大規(guī)模增殖放流奠定了基礎(chǔ)。目前，尚未見有關(guān)海水魚類T型牌標(biāo)志放流的報道。

半滑舌鰨(CynoglossussemilaevisGünther)是我國本土重要經(jīng)濟魚種，目前，其自然資源和漁獲量日益減少，加快開展半滑舌鰨增殖放流已成為保護其自然資源的重要途徑之一。近年來，我國黃渤海區(qū)開展了大規(guī)模半滑舌鰨的增殖放流工作，年放流半滑舌鰨苗種數(shù)百萬尾。為評估半滑舌鰨的放流增殖的效果，2010年以來，筆者開展了半滑舌鰨的體外掛牌標(biāo)志技術(shù)研究，篩選出了適宜半滑舌鰨苗種放流專用的T型標(biāo)志牌，并確定了適宜的標(biāo)志方法，為批量化標(biāo)志放流和增殖效果評估提供了技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)志牌規(guī)格和標(biāo)志槍

T型標(biāo)志牌主要包括錨定端、連接線和標(biāo)志牌3個部分，各部分量度如圖1所示，T-A、T-B、T-C和T-D等4種標(biāo)志牌的規(guī)格見表1。標(biāo)志牌、連接線加錨定端都是聚乙烯材制制作，安全無毒。各種標(biāo)志牌總重量與標(biāo)志牌重量與實驗魚體濕重的比值(R)

R=WT/WF×100%

(1)

式中，WT為不同規(guī)格標(biāo)志牌的總重量，WF為實驗魚的體重。4種規(guī)格的標(biāo)志牌與試驗魚體重的比值見表2。

本研究中，以標(biāo)記后實驗魚暫養(yǎng)期間脫牌率低于10%，存活率高于90%作為評價T型標(biāo)志牌是否適宜于標(biāo)志放流的依據(jù)。

表1試驗用T型標(biāo)志牌的規(guī)格特征Table 1 The size and weight of four kinds of T bar tags used in the present study

表2 標(biāo)志牌重量占魚體重量的比值Table 2 The T bar tag weight to fish weight ratio (R) in the present study

圖1 標(biāo)志試驗使用的標(biāo)志牌及規(guī)格示意圖Fig.1 Type and size schematic of T bar tags used in the present study

1.2 實驗魚及實驗設(shè)計

2011-07-10本試驗在青島忠海水產(chǎn)有限公司進行。試驗用半滑舌鰨苗種為該公司人工培育的健康苗種，苗種色澤正常，大小規(guī)則整齊，健康活潑，攝食良好。

選用平均全長5 cm(體重0.8～1.2 g)、8 cm(體重3.2～4.6 g)、12 cm(體重7.2～9.7 g)、16 cm(體重18～22 g)的苗種用于試驗,利用4種不同規(guī)格的T型標(biāo)志牌(T-A、T-B、T-C、T-D)進行了掛牌標(biāo)記。全長5 cm的苗種僅以T-A標(biāo)志牌標(biāo)記，其它3個規(guī)格的苗種分別以4種標(biāo)志牌標(biāo)記。共設(shè)置13個試驗組，每組使用試驗魚100尾，每個試驗組設(shè)置一個重復(fù)。試驗用苗種先在容積為25 m3的水泥池中暫養(yǎng)3 d后用于試驗。

試驗用魚的培育條件：水溫20～24 ℃、鹽度28～30、pH 7.8～8.2、溶解氧5 mg/L以上。暫養(yǎng)期間投喂日本產(chǎn)的日清配合飼料，投喂量為魚體重的2%～3%，每日清理培育池一次。

1.3 標(biāo)志操作方法

試驗開始前，所有試驗魚提前一天停食。標(biāo)志操作前，所有實驗魚都以MS-222進行麻醉，麻醉劑量選擇的標(biāo)準(zhǔn)是試驗魚入麻時間快，恢復(fù)時間短，無不良反應(yīng)。半滑舌鰨苗種的麻醉劑量參照劉長琳等[12]的結(jié)果，全長5～8 cm的苗種設(shè)定為50 mg/L，全長12 cm以上苗種設(shè)定為80 mg/L。

在掛牌標(biāo)志時，以專用標(biāo)志槍進行背部掛牌標(biāo)記操作。標(biāo)志槍槍頭以70%酒精消毒后使用。掛牌標(biāo)記的部位選擇被標(biāo)記魚背鰭基部下方背部肌肉最厚的部位(一般距頭部約2 cm處)，標(biāo)記槍與魚體呈45°～60°角。標(biāo)記槍頭自鱗下間隙處插入，入肌肉5 mm左右，標(biāo)志槍槍頭不穿透魚體。標(biāo)記完成后以手指輕壓標(biāo)志部位輕輕快速抽出標(biāo)記槍，使得標(biāo)志牌錨定端留在實驗魚體內(nèi)。標(biāo)志后對標(biāo)志魚用土霉素(5 mg/L)進行浸泡消毒處理，以防止傷口感染。

圖2 T型標(biāo)志牌對半滑舌鰨的標(biāo)記效果Fig.2 Real effect of T bar tagged tongue sole

1.4 標(biāo)志魚的暫養(yǎng)

掛牌標(biāo)記完成后，各個組別的試驗魚分別置于500 L的小型玻璃鋼水槽內(nèi)暫養(yǎng)15 d，暫養(yǎng)條件：水溫22～24 ℃、鹽度28～30、pH 7.8～8.2、溶解氧5 mg/L以上，充氣、流水培育，流水量為7～8個流程。暫養(yǎng)期間投喂日本產(chǎn)的日清配合飼料，投喂量為魚體重的2～3%，每日清池1次。暫養(yǎng)期間，記錄每個實驗組的死亡率和脫牌率，觀察實驗魚的游泳行為和攝食情況。

在室內(nèi)玻璃鋼水槽暫養(yǎng)15 d，將存活下來的實驗魚選擇T-A標(biāo)志的全長12 cm的半滑舌鰨苗種180尾轉(zhuǎn)移到室外池塘(1畝)進行養(yǎng)殖，同時以180尾同等規(guī)格的非標(biāo)記苗種作為對照在室外池塘內(nèi)共同培育。入池前測量實驗魚的體長和體重，經(jīng)池塘養(yǎng)殖60 d后出池，記錄成活率和脫牌率，隨機測量50尾試驗魚的體長、體重等生長情況，以評估體外掛牌標(biāo)志的效果。池塘養(yǎng)殖期間，養(yǎng)殖水溫23～26 ℃，溶解氧7 mg/L以上，養(yǎng)殖池塘每天換水約30%。養(yǎng)殖期間，先投喂活鹵蟲進行馴化誘導(dǎo)攝食，1周后轉(zhuǎn)為日清牌配合飼料。標(biāo)志后半滑舌鰨苗種在池塘養(yǎng)殖期間的特異生長率(SGR)

SGR=(eG-1) ×100%

(2)

(3)

式中，W1為起始個體重量，W2為實驗結(jié)束后個體體重，Δt為實驗持續(xù)時間。

1.5 掛牌標(biāo)志放流示范

2011年秋季，在萊州開展半滑舌鰨生產(chǎn)性放流，利用本研究開發(fā)的T-A標(biāo)志牌對平均全長12 cm的半滑舌鰨苗種進行批量標(biāo)記試驗。

1.6 實驗結(jié)果分析

試驗數(shù)據(jù)均表示為每個試驗組兩個重復(fù)的平均數(shù)。在池塘培育的標(biāo)記魚和未標(biāo)記魚的生長數(shù)據(jù)表示為Mean ± S.D.，利用單因素方差分析(ANOVA)統(tǒng)計分析體長、體重和存活率等的差異顯著性，當(dāng)P<0.05視為差異顯著，反之不顯著。統(tǒng)計分析使用SPSS(16.0版本)軟件進行。

2 結(jié) 果

2.1 掛牌標(biāo)記對苗種脫牌率、成活率的影響

標(biāo)記后試驗魚在室內(nèi)500 L的玻璃剛水槽內(nèi)流水暫養(yǎng)。在掛牌標(biāo)記操作后，試驗魚一般靜臥于池底不游動，不攝食。全長8 cm的苗種在第4 d開始逐漸攝食，游泳行為正常；全長12 cm的苗種在標(biāo)記操作2 d后游泳行為正常;在第3 d開始攝食，攝食量隨時間推移逐漸與對照組基本一致;全長16 cm的苗種在暫養(yǎng)后第2 d恢復(fù)正常游泳行為，并有部分苗種開始攝食，在第3 d攝食正常。

不同規(guī)格的T型標(biāo)志牌對不同規(guī)格的半滑舌鰨苗種進行標(biāo)志后暫養(yǎng)15 d的脫牌率和存活率見表3。平均全長5 cm的苗種：由于魚體規(guī)格過小，本研究僅以T-A標(biāo)志牌標(biāo)記，但脫牌率仍高達47%以上，且實驗魚在標(biāo)記后3 d內(nèi)全部死亡(結(jié)果未在表3列示)。平均全長16 cm的苗種：以T-A和T-B標(biāo)志牌標(biāo)記后成活率為100%，未出現(xiàn)脫牌的情況；以T-C和T-D標(biāo)志牌標(biāo)記后，脫牌率高于30%，成活率低于18%，T-D標(biāo)記組全部死亡。對于平均全長12 cm的苗種：以T-A標(biāo)志牌標(biāo)記后成活率為100%，未發(fā)現(xiàn)脫牌；以T-B標(biāo)志牌標(biāo)記后脫牌率為7%，但成活率僅為80%；以T-C和T-D標(biāo)志牌標(biāo)記后，脫牌率高于30%，成活率低于18%，T-D標(biāo)記組全部死亡。平均全長8 cm的苗種：以T-A標(biāo)志牌標(biāo)記后成活率為92%，脫牌率為7%；以T-B標(biāo)志牌標(biāo)記后脫牌率為20%，但成活率僅為57%；以T-C和T-D標(biāo)志牌標(biāo)記后，脫牌率高于45%，成活率低于5%，T-D標(biāo)記組實驗魚在標(biāo)記后3 d內(nèi)全部死亡。

由此可見，在本實驗條件下，全長5 cm以下的苗種不適宜以標(biāo)志牌標(biāo)記放流，對于全長8 cm以上的苗種標(biāo)記應(yīng)使用T-A標(biāo)志牌，對于16 cm以上苗種的標(biāo)志，可使用T-A和T-B標(biāo)志牌。

表3 不同規(guī)格的半滑舌鰨苗種以T型牌標(biāo)記后15 d的脫牌率和成活率Table 3 The tag-shedding rate and survival rate of tongue sole juveniles after tagged with T bar tags in 15 days

2.2 標(biāo)志苗種的生長

掛牌標(biāo)記后全長12 cm的半滑舌鰨苗種經(jīng)15 d的室內(nèi)暫養(yǎng),放入室外池塘培育觀察其標(biāo)記效果。共放入標(biāo)記試驗苗種180尾，同等規(guī)格未標(biāo)記的試驗魚180尾。經(jīng)2個月池塘養(yǎng)殖，試驗魚出池。計數(shù)出帶標(biāo)記牌試驗魚178尾，不帶標(biāo)記牌試驗魚182尾，試驗池塘養(yǎng)殖成活率達100%。標(biāo)記試驗魚平均全長17.37±1.97 cm，平均體重達23.83±3.02 g，未標(biāo)記魚平均全長達18.07±2.02 cm，平均體重達24.59±3.64 g。結(jié)果表明掛牌標(biāo)記魚生長與未標(biāo)記苗種生長無顯著差異(P>0.05)(表4)，標(biāo)記效果良好。

表4半滑舌鰨標(biāo)志苗種在土池飼養(yǎng)60 d后的生長指標(biāo)Table 4 The growth performance of T bar tagged tongue sole domesticated in the outdoor pond

2.3 半滑舌鰨標(biāo)志放流試驗

2011-11在萊州三山島近海進行了半滑舌鰨規(guī)模化放流試驗，放流半滑舌鰨苗種52萬尾，其中利用T-A標(biāo)志牌標(biāo)記放流平均全長12 cm的半滑舌鰨苗種1萬尾。

標(biāo)志放流流程：根據(jù)上述實驗結(jié)果，使用T-A標(biāo)志牌對平均全長12 cm的半滑舌鰨苗種進行了標(biāo)記，標(biāo)記后利用3個室內(nèi)圓形水泥池(規(guī)格為6 m×6 m×1 m)流水暫養(yǎng)48 h，出池打包后裝船放入大海。出池時計數(shù)池中苗種死亡個體數(shù)量及脫落的標(biāo)志牌數(shù)量，統(tǒng)計出該標(biāo)志牌標(biāo)記暫養(yǎng)成活率達99.9%，脫牌率為0.15%，表明標(biāo)記效果較好。

3 討 論

本研究首次研制并探討了不同規(guī)格的T型標(biāo)志牌對半滑舌鰨苗種的標(biāo)記效果，篩選出了適宜于半滑舌鰨苗種標(biāo)記的T型標(biāo)志牌，提出了規(guī)范的標(biāo)記方法，為半滑舌鰨增殖放流及效果評估提供了重要的手段和工具。

3.1 T型標(biāo)志牌規(guī)格與脫牌率和成活率的關(guān)系

T型標(biāo)志牌的錨定端、連接線和標(biāo)志牌等部分的尺寸,特別是錨定端的長度和直徑直接影響標(biāo)記效果。半滑舌鰨苗種體細長且肌肉厚度較薄，在掛牌標(biāo)記時，較大規(guī)格的T-D和T-C標(biāo)志牌很容易在魚體的錨定部位造成較大的創(chuàng)口而脫牌或造成死亡。本研究研制的小規(guī)格T-A標(biāo)志牌，大大縮短了錨定端的長度和直徑，以適合于小規(guī)格苗種的標(biāo)記。對于半滑舌鰨苗種的標(biāo)志實驗表明，標(biāo)志牌錨定部位的創(chuàng)口較小，且標(biāo)志牌所用材料與魚體連接處有較好的生物相容性，標(biāo)志后15 d傷口已愈合，標(biāo)志魚的脫牌率和死亡率低。在對條紋鱸(Moronesaxatilis)的標(biāo)志放流研究中，研究者認為T型標(biāo)志牌錨定端長度應(yīng)盡量等于或者小于被標(biāo)志魚的脊椎骨間距[13]。在本研究中，對于小規(guī)格的苗種，利用T-A標(biāo)志牌取得了較好的標(biāo)記效果，但使用錨定端長度和直徑都較大的T-C和T-D類型的標(biāo)志牌則造成了較高的脫牌率。因此，對于鲆鰈魚類小規(guī)格苗種的標(biāo)志研究，首先應(yīng)考慮標(biāo)志牌錨定端直徑的大小，同時應(yīng)考慮標(biāo)志牌重量和操作方法等因素。

已有研究表明，T型標(biāo)志牌的連接線長度可能影響標(biāo)記成功率，連接線過短可能導(dǎo)致較高的脫牌率[14]。但另一方面，較長的連接線會增加標(biāo)志牌的整體重量，在水里產(chǎn)生較大的阻力，進而對魚體的游泳行為造成影響，最為主要的是標(biāo)志魚被捕食者發(fā)現(xiàn)的幾率增加。因此，在制作T型標(biāo)志牌時應(yīng)通過實驗而確定適宜的連接線長度。Jolivet等[7]在研究歐洲無須鱈(Merlucciusmerluccius)標(biāo)志放流時提出，標(biāo)志牌重量與魚體重的比值(R)>2時被標(biāo)志魚死亡快且死亡率高，脫牌率升高。在本研究中，對于平均全長8 cm的苗種，T-A標(biāo)志牌較為適宜，結(jié)合表2中的R值，認為當(dāng)R<0.63時標(biāo)志牌適宜于標(biāo)志放流。而對于全長為12 cm以上的大規(guī)格苗種，考慮到標(biāo)記后的成活率和脫牌率，以R=0.3來評價標(biāo)志牌對半滑舌鰨的標(biāo)志效果較為適宜，當(dāng)R<0.3時標(biāo)志牌較適宜于標(biāo)記操作。在本研究條件下，從脫牌率、存活率和實驗魚的標(biāo)志后行為以及生長等數(shù)據(jù)綜合分析，T-A標(biāo)志牌適宜于全長8 cm以上半滑舌鰨苗種的標(biāo)志，而T-B標(biāo)志牌適宜于16 cm以上大規(guī)格苗種的標(biāo)志。同時，該T-A型標(biāo)志牌也可用于其它鲆鰈類苗種掛牌標(biāo)志。

3.2 其它因素對掛牌標(biāo)記效果的影響

T型標(biāo)志牌的掛牌標(biāo)志多采用標(biāo)志槍操作，Davis等[15]發(fā)現(xiàn)標(biāo)志槍的槍頭過短也可引起較高的脫牌率。本研究中，根據(jù)4種不同的T型標(biāo)志牌錨定端的直徑制作了不同的標(biāo)志槍，要求槍尖和撞針的直徑與標(biāo)志牌錨定端吻合，槍尖入魚體后不會產(chǎn)生倒掛而造成額外損傷或者將標(biāo)志牌拖出。另外，在標(biāo)記操作時，要求槍尖斜向入肌肉深度控制在5 mm左右，以不穿透魚體為好，避免對魚體造成過大損傷。

在利用T型標(biāo)志牌標(biāo)記放流魚時，由于錨定端需鎮(zhèn)入魚體內(nèi)，因此會在魚體標(biāo)志部位造成創(chuàng)傷。對鮭魚(Salmosalar)的標(biāo)志技術(shù)研究表明，如若標(biāo)記操作或操作后處理不當(dāng)，或者標(biāo)記后不經(jīng)暫養(yǎng)直接放入野生環(huán)境中，標(biāo)志魚的標(biāo)志部位容易惡化，形成壞死，直接導(dǎo)致實驗魚的死亡或生長抑制[14，16]。因此，在標(biāo)志放流過程中，應(yīng)對標(biāo)記后的魚體進行創(chuàng)口的消毒處理并對標(biāo)記后的實驗魚進行暫養(yǎng)馴化，以提高標(biāo)志魚的成活率。本研究的標(biāo)記操作中，標(biāo)記前對標(biāo)志槍頭進行了消毒處理并在標(biāo)記后對放流魚進行消毒處理，標(biāo)志魚體上的標(biāo)記創(chuàng)口可在較短時間內(nèi)愈合，對實驗魚的生長和存活影響較??；另外，標(biāo)記操作時，T型標(biāo)志牌標(biāo)記部位選在試驗魚頭部后方側(cè)線上方肌肉最厚處，此處遠離中樞神經(jīng)系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)，不會對標(biāo)志魚產(chǎn)生過多的生理和代謝脅迫；同時，標(biāo)記操作時標(biāo)志槍傾斜并與魚體呈45°～60°角，可使標(biāo)記后標(biāo)志牌向魚體側(cè)后方傾斜并與魚體游泳方向保持一致，減少游泳阻力的影響。

目前，開展的不同類型的標(biāo)志牌的標(biāo)記效果試驗多是在實驗室條件下進行，在標(biāo)記后暫養(yǎng)周期的長短可能對評價一種標(biāo)志牌的效果產(chǎn)生影響。前人研究表明，短期內(nèi)(2～5 d)的暫養(yǎng)觀察可能無法精確評估一種標(biāo)志牌對實驗魚的效果，因此一般標(biāo)志后的暫養(yǎng)實驗時間需5 d以上，暫養(yǎng)時間越長，對于標(biāo)志牌的標(biāo)志效果就越容易評價和確定[17]。本研究中，半滑舌鰨標(biāo)記魚的暫養(yǎng)時間為15 d，同時在池塘中進行暫養(yǎng)時生長無差異，同時在后續(xù)大批量標(biāo)志放流時中發(fā)現(xiàn)較高的成活率和較低的脫牌率，表明本研究使用的暫養(yǎng)和標(biāo)志效果評價方法是適宜的。

3.3 適宜標(biāo)志苗種的規(guī)格

Nielson等[1]提出掛牌標(biāo)記一般用于個體較大的魚，如體長在15 cm以上的魚[13-14]。本研究使用的標(biāo)志用苗種都在16 cm以下，全長5 cm的苗種由于體型過于單薄和弱小，不適用于掛牌標(biāo)記操作，其可能原因是小規(guī)格苗種難以忍受固著時的操作壓力所造成的創(chuàng)傷，從而造成死亡。對于全長8 cm以上苗種，雖然其全長達到一定規(guī)格，但苗種體重較小，在進行苗種標(biāo)志時，需特別注意標(biāo)志牌的重量不可過大，重量過大的標(biāo)志牌可對苗種游泳和攝食行為造成障礙，且很容易在自然水體被其天敵生物捕食。因此，開發(fā)適宜半滑舌鰨苗種標(biāo)記的標(biāo)志牌時，應(yīng)盡量制作小規(guī)格標(biāo)志牌。從本研究結(jié)果看，全長8 cm的苗種在以T-A標(biāo)志牌標(biāo)記后雖成活率達90%以上，但仍有少量死亡和脫牌，本研究雖未選擇10 cm左右的苗種進行標(biāo)記試驗，考慮到苗種的規(guī)格、身體厚度以及標(biāo)記操作技術(shù)，建議今后標(biāo)志放流時，使用T-A標(biāo)志牌，選擇全長10 cm以上的半滑舌鰨苗種進行標(biāo)記放流為宜。

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