楊德洪，魏 勇

研究顯示，隨著增齡老年人易出現(xiàn)T 淋巴細(xì)胞克隆向Th1 亞群分化［1］，進(jìn)而出現(xiàn)Th1 型細(xì)胞因子分泌增多，抑制Th2 型細(xì)胞因子的分泌，即所謂的Thl/Th2極化現(xiàn)象，從而破壞了Thl/Th2 平衡在機(jī)體免疫防御反應(yīng)的調(diào)節(jié)中所具有關(guān)鍵性作用，導(dǎo)致糖尿病、腫瘤和自身免疫性疾病等發(fā)病率增加。大量研究也證實(shí)，太極拳運(yùn)動(dòng)可以延緩衰老，減少老年性疾病的發(fā)生率，提高生活質(zhì)量［2］，但其確切機(jī)制目前尚不清。本研究旨在檢測(cè)太極拳運(yùn)動(dòng)的不同時(shí)段Thl/Th2 型細(xì)胞因子mRNA 的表達(dá)情況，并進(jìn)一步了解太極拳運(yùn)動(dòng)對(duì)Th1/Th2 型細(xì)胞因子平衡的影響，探討太極拳健身的可能免疫學(xué)機(jī)制。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

自愿參加本次測(cè)試的中老年女性21 人，年齡在50～65歲之間，均為近期無(wú)運(yùn)動(dòng)習(xí)慣的太極拳運(yùn)動(dòng)的初學(xué)者。臨床醫(yī)學(xué)檢查均排除高血壓、冠心病、腫瘤、神經(jīng)、精神類(lèi)疾病及其他慢性消耗性疾病和影響HSP70 表達(dá)的有關(guān)因素。研究對(duì)象的基本情況見(jiàn)表1。

表1 研究對(duì)象基本情況(Mean±SD)

1.2 研究方法

1.2.1 訓(xùn)練計(jì)劃

1)運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目:以學(xué)練國(guó)際推廣套路48 式太極拳為項(xiàng)目?jī)?nèi)容。

2)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度:采用遙測(cè)心率儀對(duì)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度進(jìn)行監(jiān)控。每月調(diào)整一次強(qiáng)度，通過(guò)改變練習(xí)時(shí)重心高度、練習(xí)間歇時(shí)間調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，使強(qiáng)度位于靶心率之間。靶心率計(jì)算公式:靶心率=60%～80% ×(220－年齡)

3)運(yùn)動(dòng)時(shí)間和頻率:每次練習(xí)持續(xù)1～1.5 小時(shí)，每周練習(xí)3 次(隔天一次)，實(shí)驗(yàn)周期共6 個(gè)月(2004年10月～2005年3月)。

整個(gè)太極拳學(xué)習(xí)和訓(xùn)練過(guò)程由專(zhuān)人進(jìn)行指導(dǎo)。

1.2.2 取材

分別于實(shí)驗(yàn)前、運(yùn)動(dòng)后第3 個(gè)月、第6 個(gè)月的晨7:30－8:00 對(duì)各受試者進(jìn)行樣品采集。抽肘靜脈血2 ml 全血注入肝素(10 U/ml)抗凝試管，然后立即離心(1 500 rpm，10 min)。以紅細(xì)胞裂解液溶解全血中的紅細(xì)胞后，轉(zhuǎn)至1.5 ml eppendorf 管中，制備成白細(xì)胞沉淀保存于－80℃冰箱備用。

1.2.3 細(xì)胞因子mRNA 檢測(cè)

1.2.3.1 抽提RNA 合成cDNA 使用經(jīng)典法RNA 抽提試劑盒從白細(xì)胞沉淀中抽提總RNA (試劑盒由上海申能博采生物科技有限公司提供)。按照RevertAidTM 第一鏈cDNA 合成試劑盒把2 μg RNA 用作模板合成cDNA(試劑盒購(gòu)自立陶宛MBI Fermentas 公司)。在0.2 ml effendorf 管中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)總體積20 μl。合成的cDNA 儲(chǔ)存在－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè) 根據(jù)Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)中公開(kāi)發(fā)表的基因序列，設(shè)計(jì)INF－γ、IL－2、IL－4、IL－10 和GAPDH 的引物和探針，見(jiàn)表2。各探針在兩端分別具有報(bào)告基團(tuán)6－羧基熒光素(6－carboxyfluorescein，6－FAM)(位于5＇端)，和淬滅基團(tuán)6－羧基－四甲基羅丹明(6－ carboxy－ tetramethyl－ rhodamine，TAMRA)(位于3＇端)。

表2 INF－γ、IL－2、IL－4、GAPDH 的引物和探針

定量PCR 檢測(cè)在Rotor－Gene RG 3000 (Corbett，Australia)熒光PCR 儀上進(jìn)行。定量PCR 反應(yīng)液包含:10 × PCR 反應(yīng)緩沖液2.5 μl，25 mM MgCl21.5 μl，上游及下游引物(400μM)各0.1 μl，0.1μl 熒光素標(biāo)記探針(50 μM)，10 mM dNTP 0.5 μl，0.5μl Taq DNA 酶(1.25 units)，2 μl cDNA，DEPC－H20 17.7 μl。上述反應(yīng)液可保存于－20℃。定量PCR 反應(yīng)條件:50℃預(yù)熱300 s;95℃變性300 s;95℃20 s，60℃60 s，40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在60℃時(shí)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算每個(gè)基因的拷貝數(shù)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)測(cè)試指標(biāo)均表示為Mean± SD，采用SPSS11.0 統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。顯著性標(biāo)準(zhǔn)以P ＜0.05 為有顯著性差異，P ＜0.01 為有非常顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 6 個(gè)月太極拳運(yùn)動(dòng)干預(yù)后外周血白細(xì)胞INF－γ mRNA、IL－4 mRNA 的變化

經(jīng)過(guò)太極拳運(yùn)動(dòng)干預(yù)，中老年婦女外周血白細(xì)胞INF－γ mRNA 的表達(dá)量逐漸降低，3、6月時(shí)表達(dá)量均與干預(yù)前相比存在明顯差異。IL－4 mRNA 表達(dá)量先降低后回升，但仍未達(dá)初始水平，且3月時(shí)的表達(dá)量與干預(yù)前相比存在顯著性差異(表3)。

表3 白細(xì)胞INF－γ mRNA、IL－4 mRNA的變化(Mean±SD，n=21)

2.2 6 個(gè)月太極拳運(yùn)動(dòng)干預(yù)后外周血白細(xì)胞INF－γ mRNA/IL－4 mRNA 的變化

經(jīng)過(guò)太極拳運(yùn)動(dòng)干預(yù)，中老年婦女外周血白細(xì)胞INF－γ mRNA 與IL－4 mRNA 比值逐漸降低，與干預(yù)6月相比干預(yù)前和干預(yù)3月均存在明顯差異(如表4)。

表4 白細(xì)胞INF－γ mRNA 與IL－4 mRNA 比值的變化

3 分析與討論

Thl/Th2 細(xì)胞的調(diào)節(jié)對(duì)維持機(jī)體正常的免疫功能至關(guān)重要［3］。在生理?xiàng)l件下，機(jī)體Th1/Th2 細(xì)胞的免疫功能處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，一旦這種平衡發(fā)生偏離，機(jī)體就會(huì)趨向疾病狀態(tài)。當(dāng)Th1 細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)時(shí)，機(jī)體可產(chǎn)生細(xì)胞免疫亢進(jìn)相關(guān)性疾病，當(dāng)Th2 細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)時(shí)，機(jī)體可發(fā)生體液免疫亢進(jìn)相關(guān)性疾病。Th1 和Th2 細(xì)胞因子所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)又可相互調(diào)節(jié)或交叉調(diào)節(jié)［4］。因此，Thl/Th2 的失衡與自身免疫病、過(guò)敏性疾病、腫瘤、移植排斥反應(yīng)以及感染性疾病的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。一般Thl 細(xì)胞可分泌IFN－γ 而不分泌IL－4，Th2 細(xì)胞可分泌IL－4 而不分泌IFN－γ，通常以這兩種細(xì)胞因子作為鑒別Thl、Th2 的標(biāo)志。

3.1 衰老與Th1/Th2 型細(xì)胞因子表達(dá)

以往檢測(cè)細(xì)胞因子多通過(guò)培養(yǎng)和絲裂原刺激方式，從蛋白水平觀(guān)察細(xì)胞因子，顯示的是細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)能力而未必能完全反映機(jī)體當(dāng)時(shí)細(xì)胞因子的表達(dá)狀況。如欲客觀(guān)反映機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和機(jī)能狀況，尚需在無(wú)任何刺激的狀態(tài)下檢測(cè)自發(fā)性細(xì)胞因子mRNA的基因表達(dá)水平。

熒光實(shí)時(shí)定量PCR 的問(wèn)世為檢測(cè)細(xì)胞中微量自發(fā)性Th1/Th2 特征性細(xì)胞因子mRNA 的表達(dá)提供了技術(shù)保障。根據(jù)Taqman 技術(shù)對(duì)靶基因mRNA 表達(dá)進(jìn)行定量分析是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)［5］，其原理是將靶基因特異性的一組引物和熒光標(biāo)記探針與模板cDNA 進(jìn)行雜交，然后在多聚酶鏈反應(yīng)過(guò)程中利用Taq 酶的3’－核酸外切酶活性水解探針3’段的熒光淬滅基團(tuán)，獲得熒光激發(fā)信號(hào)，后者與模板量呈正相關(guān)。通常將這種熒光實(shí)時(shí)定量PCR 分為相對(duì)定量和絕對(duì)定量?jī)深?lèi)。相對(duì)定量分析以靶基因陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)分析靶基因與內(nèi)參照基因(如GAPDH 等)的比值，獲得待測(cè)樣本中靶基因表達(dá)的相對(duì)值。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是容易開(kāi)發(fā)，但所得的數(shù)值受陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞的影響，不同的實(shí)驗(yàn)室若采用不同的陽(yáng)性細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)，則結(jié)果難以相互比較。絕對(duì)定量是采用拷貝數(shù)已知的DNA 片斷作為標(biāo)準(zhǔn)，該片斷可采用基因克隆或PCR 擴(kuò)增獲得。由于絕對(duì)定量檢測(cè)是以一種可以標(biāo)準(zhǔn)化的DNA 參照物作為基準(zhǔn)，因而不同實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果具有可比性。絕對(duì)定量PCR 檢測(cè)技術(shù)是定量PCR 的發(fā)展方向。

本研究采用陳佩杰教授自主研發(fā)的實(shí)時(shí)定量PCR 細(xì)胞因子檢測(cè)專(zhuān)利技術(shù)［6］，對(duì)健康中老年婦女外周血白細(xì)胞的自發(fā)性Th1/Th2 細(xì)胞因子的基因表達(dá)進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量的觀(guān)測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)健康中老年婦女確實(shí)存在自發(fā)性細(xì)胞因子的基因表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)該項(xiàng)技術(shù)能夠評(píng)價(jià)生理狀態(tài)下免疫細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)。

研究顯示，隨增齡細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)發(fā)生了復(fù)雜的變化，一些細(xì)胞因子生成減少(如IL－2)，而另一些細(xì)胞因子產(chǎn)生增多(如IL－1、IL－6 和TNF－α)，其中主要是Thl 型細(xì)胞因子向Th2 型細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)化［7］和炎癥性細(xì)胞因子產(chǎn)生增多。但是Sakata 等研究發(fā)現(xiàn)老年人外周血CD4 +T 細(xì)胞產(chǎn)生IFN－γ 的水平高于年輕組，而IL－4 水平降低，提示老年個(gè)體有Thl 的極化現(xiàn)象［1］。對(duì)于健康中老年人而言，由于衰老而出現(xiàn)的Th1/Th2 極化方向目前尚沒(méi)有定論。本研究結(jié)果顯示，健康中老年婦女在未接受任何干預(yù)時(shí)外周血白細(xì)胞IFN－γmRNA 和IL－4 mRNA 的比值為0.5589±0.012。由于目前沒(méi)有公認(rèn)的健康人群Th1/Th2 細(xì)胞因子平衡的標(biāo)準(zhǔn)，本研究也沒(méi)有涉及不同年齡組之間的比較，因此，僅憑此結(jié)果還不能判斷本研究的中老年婦女是否存在Th1/Th2 極化現(xiàn)象以及極化方向。

3.2 太極拳運(yùn)動(dòng)對(duì)Th1/Th2 平衡的影響

運(yùn)動(dòng)對(duì)Th1/Th2 淋巴細(xì)胞因子影響的研究很少。Moyna 等［8］研究了平時(shí)經(jīng)?；顒?dòng)和活動(dòng)很少的男性和女性在遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后血清Th1/Th2 代表性細(xì)胞因子的變化，結(jié)果證實(shí)運(yùn)動(dòng)能夠改變Th1/Th2 平衡。

Suzuki K 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，力竭運(yùn)動(dòng)可以導(dǎo)致Th1/Th2 平衡向Th2 偏移。與此不同的是，Lancaster GI等［10］的研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)后即刻和恢復(fù)期Th1 型淋巴細(xì)胞在循環(huán)中的百分比和數(shù)目以及其代表性細(xì)胞因子IFN－γ 均明顯下降，但Th2 淋巴細(xì)胞及其代表性細(xì)胞因子IL－4 卻沒(méi)有明顯變化。Steensberg A［11］等的研究也發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)后即刻和2 小時(shí)循環(huán)血中的Th1 細(xì)胞比例被抑制，而Th2 細(xì)胞比例沒(méi)有變化。Kohut ML［12］等卻發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)可以增加Th1 相關(guān)細(xì)胞因子IL－1 和IFN－γ，而對(duì)Th2 相關(guān)細(xì)胞因子IL－10 沒(méi)有影響。分析這些不一致的研究結(jié)果，可能與各研究的研究對(duì)象、運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間等有關(guān)。

本研究顯示太極拳運(yùn)動(dòng)后中老年婦女外周血白細(xì)胞INF－γ mRNA 的表達(dá)量逐漸降低，3、6月時(shí)表達(dá)量均與干預(yù)前相比存在明顯差異。IL－4 mRNA 表達(dá)量先降低后回升，但仍未達(dá)初始水平，且3月時(shí)的表達(dá)量與干預(yù)前相比存在顯著性差異。而INF－γ mRNA 與IL－4 mRNA 比值逐漸降低，與干預(yù)6月相比干預(yù)前和干預(yù)3月均存在明顯差異。考慮到本研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象為太極拳初學(xué)者，前3 個(gè)月的太極拳鍛煉對(duì)機(jī)體的應(yīng)激不大，所以從第6月和運(yùn)動(dòng)前相比，其結(jié)果更能反映太極拳運(yùn)動(dòng)的影響。因此，本研究的結(jié)果可以簡(jiǎn)化為INF－γ mRNA 下降明顯，IL－4 mRNA 沒(méi)有明顯變化，INF－γ mRNA 與IL－4 mRNA 比值下降明顯，提示太極拳運(yùn)動(dòng)使中老年婦女Th1/Th2 向Th2 極化，這一結(jié)果與文獻(xiàn)［9－11］相似。

運(yùn)動(dòng)影響Th1/Th2 平衡的機(jī)理還不明確。Elenkov IJ［13－14］通過(guò)分析文獻(xiàn)認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)所致的糖皮質(zhì)激素和兒茶酚胺等應(yīng)激激素可能會(huì)選擇性地抑制Th1 細(xì)胞免疫軸，使得機(jī)體免疫機(jī)能向Th2 介導(dǎo)的體液免疫偏移。太極拳影響Th1/Th2 細(xì)胞因子的機(jī)理可能也與運(yùn)動(dòng)后激素分泌以及與免疫系統(tǒng)的相互作用有關(guān)，但確切機(jī)制還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.3 中老年婦女太極拳運(yùn)動(dòng)后Th1/Th2 變化的可能意義

研究顯示，隨著增齡，老年人易出現(xiàn)T 淋巴細(xì)胞克隆向Th1 亞群分化［1］，進(jìn)而出現(xiàn)Th1 型細(xì)胞因子分泌增多，抑制Th2 型細(xì)胞因子的分泌，即所謂的Thl/Th2 極化現(xiàn)象，從而破壞了Thl/Th2 平衡在機(jī)體免疫防御反應(yīng)的調(diào)節(jié)中所具有關(guān)鍵性作用，導(dǎo)致糖尿病、腫瘤和自身免疫性疾病等發(fā)病率增加。

從細(xì)胞整體水平而言，細(xì)胞因子譜有Thl 或Th2型細(xì)胞因子占優(yōu)勢(shì)的格局，這提示特定的細(xì)胞因子在特定的體內(nèi)環(huán)境下會(huì)發(fā)生相對(duì)優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)化，正是這種轉(zhuǎn)化滿(mǎn)足了機(jī)體對(duì)不同抗原刺激應(yīng)答的實(shí)際需要［15］。如果能人為地選擇性誘導(dǎo)或調(diào)控Th1/Th2 細(xì)胞的免疫反應(yīng)，促使Th1/Th2 細(xì)胞反應(yīng)的動(dòng)態(tài)平衡，則將十分有利于疾病轉(zhuǎn)歸。這應(yīng)該是應(yīng)用各種方法調(diào)整衰老機(jī)體體內(nèi)Thl/Th2 平衡以延緩衰老，減少老年相關(guān)疾病發(fā)病率的理論基礎(chǔ)。鄧陽(yáng)勇等［16］的研究證實(shí)了這一方法的可行性。他們通過(guò)蘆薈多糖調(diào)節(jié)衰老模型小鼠Th1/Th2 細(xì)胞因子失衡，使其偏移逆轉(zhuǎn)，則減少了老年性疾病的發(fā)生，延緩了衰老。

大量研究也證實(shí)，太極拳可以延緩衰老，減少老年性疾病的發(fā)生率，提高生活質(zhì)量，但其確切機(jī)制目前尚不清。本研究結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)太極拳運(yùn)動(dòng)干預(yù)后INF－γ mRNA 下降明顯，IL－4 mRNA 沒(méi)有明顯變化，INFγ mRNA 與IL－4 mRNA 比值下降明顯，提示太極拳運(yùn)動(dòng)使中老年婦女Th1/Th2 向Th2 極化。Sakata－Kaneko S［1］的研究證實(shí)，衰老使老年人Th1 型細(xì)胞因子分泌增多，抑制Th2 型細(xì)胞因子的分泌，即所謂的Thl/Th2 向Thl 極化現(xiàn)象。結(jié)合這一結(jié)果，作者認(rèn)為太極拳運(yùn)動(dòng)使衰老個(gè)體Thl 極化的細(xì)胞因子分泌逆轉(zhuǎn)，從而使衰老機(jī)體Th1/Th2 細(xì)胞反應(yīng)重新回歸動(dòng)態(tài)平衡。進(jìn)一步提示，太極拳運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)體的Thl/Th2 型細(xì)胞因子的平衡也許是太極拳調(diào)節(jié)中老年機(jī)體免疫力，增強(qiáng)健身效果的可能機(jī)制，但這還有待實(shí)驗(yàn)研究予以驗(yàn)證。

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