楊 敏 劉 軍

仔犬是指45日齡以內(nèi)的犬即從母體分娩到斷奶階段的犬。這一階段的犬生長發(fā)育旺盛而不完善。為保障仔犬發(fā)育，食物的轉(zhuǎn)換（從母乳哺乳到采食）與免疫接種是必要的。飼養(yǎng)管理的調(diào)整作為應(yīng)激因素影響仔犬的免疫應(yīng)答能力，從而影響其抗病能力。IFN-γ（Interferonγ）屬淋巴細(xì)胞干擾素，是由活化的T 淋巴細(xì)胞在誘生劑等作用下產(chǎn)生的糖蛋白、具有免疫調(diào)節(jié)功能。它參與誘導(dǎo)主要組織相容性復(fù)合體類抗原的表達(dá)、增強(qiáng)T 輔助細(xì)胞抗體產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。IFN-γ也是動(dòng)物巨噬細(xì)胞的主要活化因子。作為犬機(jī)體免疫能力的標(biāo)示物，IFN-γ mRNA 檢測用于評(píng)估心臟病患犬的免疫調(diào)節(jié)能力以及杜氏利士曼原蟲、新孢子蟲等寄生蟲病時(shí)犬T CD8+細(xì)胞數(shù)量及活性。本試驗(yàn)擬探討20 ～45日齡仔犬IFN-γ mRNA 表達(dá)規(guī)律，以期揭示仔犬生長發(fā)育規(guī)律并完善飼養(yǎng)管理方案。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)犬為德國牧羊犬仔犬，6 窩共計(jì)33 頭，由沈陽警犬基地分窩飼養(yǎng)。犬舍約12m2，分為室內(nèi)、室外，可自由活動(dòng)，不限制飲水。小于20日齡的仔犬飼喂母乳，20日齡仔犬接受驅(qū)蟲（藥物為左旋咪唑）；大于20日齡小于45日齡仔犬補(bǔ)飼米粥、肉沫粥等流食；35日齡仔犬接受免疫接種（荷蘭英特威犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒二聯(lián)苗）；大于45日齡仔犬?dāng)嗄?、飼喂全價(jià)犬糧。20日齡實(shí)驗(yàn)犬為第1 組、35日齡為第2 組、45日齡為第3 組。

（二）主要試劑

RNAiso Plus、TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0、TaKaRa DL2000 為TaKaRa 公司產(chǎn)品，GeneFinder 為百維信公司產(chǎn)品，EDTA、Tris、硼酸、瓊脂糖為Sigma 公司產(chǎn)品，異丙醇、氯仿、75%酒精為江萊生物科技有限公司產(chǎn)品。

（三）血樣采集

采集20日齡（驅(qū)蟲前）、35日齡（免疫接種前）、45日齡仔犬前肢頭靜脈血1ml（肝素抗凝劑），-80℃保存。

（四）總RNA 提取及純度檢測

參照試劑盒操作過程，每250μl 全血加入1.5ml RNAiso。酶標(biāo)儀檢測RNA 純度，取RNA0D260/0D280值在1.7～2.0 范圍內(nèi)的樣品-80℃凍存。

（五）犬IFN-γ mRNA 表達(dá)量檢測

采用Trizol 法從全血中抽提總RNA，以cDNA 為模板，進(jìn)行犬IFN-γ、GPDH 基因cDNA 的PCR 擴(kuò)增。用于擴(kuò)增犬IFN-γ、GPDH 基因的引物參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)。引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，序列見表1。反轉(zhuǎn)錄體系為10μl：MgCl2 2μl、10×RT Buffer 1μl、dNTP Mixture (10Mm) 1μl、RNase inhibitor 0.25μl、AMV Reverse Transcriptase 0.5μl、Oligo dT-Adaptor Primer 0.5μl、RNA Sample 2μl。PCR 反應(yīng)體系為25μl：5×PCR Buffer 5μl、TaKaRa EX Taq HS 0.125μl、上下游特異引物各0.25μl (各20Mm)、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2μl。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42℃ 30 min；99℃ 5 min；5℃ 5 min。PCR 反應(yīng)條件：94℃ 2 min；94℃ 30 s，53℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 4 min，4℃保存結(jié)束。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行2% 瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果經(jīng)G：box 凝膠成像系統(tǒng)成像、GeneTool 軟件分析得出各基因的灰度值。計(jì)算目標(biāo)基因與內(nèi)參基因灰度值的比值（IFN-γ／GPDH）后，進(jìn)行半定量分析。

（六）數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理

SPSS.13.0 統(tǒng)計(jì)分析20日齡、35日齡、45日齡時(shí)仔犬IFN-γ mRNA 檢出率及表達(dá)差異，計(jì)算x2、P 值。

表1 引物序列

二、結(jié) 果

（一）全血中提取總RNA

使用RNAiso Plus 從犬前臂頭靜脈全血中提取總RNA，電泳結(jié)果見圖2-1。

（二）RT-PCR 產(chǎn)物

使用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0 得到RTPCR 產(chǎn)物，GPDH 大小為283bp、IFN-g 大小為203bp，見圖2-2。

圖2-1 全血總RNA 提取結(jié)果電泳圖 泳道M:DL2,000、泳道1、4：新鮮的全血樣品、泳道2、3：-80℃保存的全 血樣品。

圖2-2 IFN-g 、GPDH RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。泳道M: DL2,000、泳道1：20日齡IFN-g 產(chǎn)物、泳道2：20日齡GPDH產(chǎn)物、泳道3：35日齡IFN-g 產(chǎn)物、泳道4：35日齡GPDH 產(chǎn)物、泳道5：45日齡IFN-g 產(chǎn)物、泳道6：45日齡GPDH 產(chǎn)物。

(三)20、35、45日齡IFN-g mRNA 檢出率、相對(duì)表達(dá)量及差異分析

受試組中20日齡組IFN-g mRNA 的檢出率最高為57.6%。隨日齡增加，35日齡、45日齡組IFN-g mRNA 檢出率顯著下降（x2=6.628、P=0.036）。45日齡組IFN-g mRNA表達(dá)量極顯著高于20日齡、35日齡組（P＜0.001）。20日齡組、35日齡組IFN-g mRNA 表達(dá)差異不顯著（P＞0.05）。

表2-1 20、35、45日齡組IFN-γ mRNA 檢出率及表達(dá)量

表2-2 20、35、45日齡組IFN-γ mRNA 表達(dá)差異

三、討 論

仔犬的飼養(yǎng)管理是犬養(yǎng)殖成功與否的關(guān)鍵。處于這一時(shí)期的犬生理機(jī)能不健全、各組織器官的適應(yīng)能力和抗病力都很差。仔犬出生到斷乳時(shí)因各種原因?qū)е碌乃劳雎矢哌_(dá)34%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示小于20日齡的仔犬在母乳飼喂條件下，IFN-g mRNA 檢出率為57.6%，顯著高于35日齡、45日齡添加米粥的飼喂條件下的檢出率。這一研究結(jié)果說明母乳可為一半以上的仔犬營造一個(gè)良好的營養(yǎng)環(huán)境，促進(jìn)仔犬發(fā)育階段犬免疫系統(tǒng)的生長發(fā)育、提高仔犬免疫能力，進(jìn)而發(fā)揮疾病預(yù)防和促進(jìn)遠(yuǎn)期健康的作用。母乳仍是目前養(yǎng)犬業(yè)最應(yīng)提倡采用喂養(yǎng)仔犬的食物。不僅營養(yǎng)需要，在味覺、消化吸收等方面乳類食品也是仔犬最適合的食物。研究表明新生仔犬胃腸道對(duì)高分子物質(zhì)的吸收能力較成年犬高出一百倍。質(zhì)量高、數(shù)量充足的母乳獲取是短期內(nèi)激發(fā)仔犬系統(tǒng)免疫的關(guān)鍵。但最低的IFN-g mRNA 表達(dá)量同時(shí)也說明母乳對(duì)仔犬機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能是有限的。飼養(yǎng)管理者應(yīng)考慮母犬的泌乳量一般在21 天左右達(dá)到高峰后逐漸下降，初乳與乳內(nèi)免疫球蛋白的含量相差較大等情況，合理安排仔犬哺乳期的長短、適時(shí)斷奶：哺乳期過短，仔犬生長發(fā)育緩慢，成年后生產(chǎn)力低；哺乳期過長，母犬發(fā)情、配種延后，影響正常繁殖過程。同時(shí)，研究顯示犬是可以通過胎盤和泌乳兩種途徑將免疫球蛋白傳遞給子代的動(dòng)物。飼養(yǎng)管理者也可以通過母犬被動(dòng)免疫等方法提高乳汁營養(yǎng)含量，從而加強(qiáng)仔犬免疫能力。

仔犬免疫系統(tǒng)隨著犬齡的增長不斷向前發(fā)育成熟。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著犬齡增長，IFN-g mRNA 表達(dá)量于35日齡時(shí)有所增加但并不明顯，45日齡時(shí)則表現(xiàn)出極顯著增加。這說明仔犬的免疫系統(tǒng)已經(jīng)向前發(fā)育。35日齡、45日齡組IFN-g mRNA 較低的檢出率同時(shí)說明仔犬免疫系統(tǒng)發(fā)育存在個(gè)體差異性：發(fā)育良好的仔犬在45日齡時(shí)已經(jīng)擁有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)能力，而大部分仔犬還幾乎沒有。為大于20日齡的仔犬補(bǔ)料（逐漸在奶中添加牛奶、米湯、稀飯逐漸過渡到添加蛋羹和肉末等營養(yǎng)價(jià)值高易消化的食物）是保證生長發(fā)育正在上升階段的仔犬營養(yǎng)需求的關(guān)鍵。35日齡組仔犬IFN-g 檢出率顯著下降、IFN-g mRNA 表達(dá)量略高于20日齡說明補(bǔ)料是不足夠的，飼養(yǎng)管理者可以通過添加復(fù)方苦芩等中藥、提早免疫接種等方式增強(qiáng)仔犬免疫調(diào)節(jié)能力。

綜上所述，仔犬發(fā)育階段，IFN-γ mRNA 表達(dá)個(gè)體差異顯著、檢出個(gè)體表達(dá)量隨日齡增長而增加。目前，飼養(yǎng)管理可以通過加強(qiáng)母犬?dāng)嗄糖盃I養(yǎng)、盡量選擇有免疫佐劑功效的驅(qū)蟲藥、選取仔犬免疫力空白期實(shí)施被動(dòng)免疫等方法保證犬健康地度過仔犬發(fā)育階段。幼犬發(fā)育階段IFN-γ mRNA 表達(dá)規(guī)律有待于進(jìn)一步研究。