★ 嚴子玲 于洋＊ 何金蓮 候遠鑫 (廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 廣州510006)

中藥配伍研究是方劑學(xué)研究的重點。五味子是中醫(yī)臨床的一味常用藥，在大多方劑中作“佐”藥配伍應(yīng)用，即通過某種途徑，增強方中其他藥物的治療作用，具有規(guī)律性。五味子散首載于宋·許叔微《普濟本事方》，又名溏泄散，由五味子二兩，吳茱萸半兩組成［1］，主治腎泄。吳茱萸為蕓香科吳茱萸屬植物吳茱萸(Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.)干燥近成熟的果實［2］，所含化學(xué)成分類型較多，其中生物堿類為其主要有效成分［3］。如吳茱萸堿和吳茱萸次堿具有抗菌、抗癌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗血小板聚集、抗血栓形成、體溫調(diào)節(jié)和保護心臟等藥理作用［4－5］。

五味子與吳茱萸的配伍研究目前少有報道，本文以吳茱萸為模型藥物，以主要活性成分吳茱萸堿、吳茱萸次堿為研究對象，建立適用于吳茱萸生物堿吸收研究的大鼠原位灌注模型，研究吳茱萸生物堿在五味子提取物以及在P－pg抑制劑作用下的吸收差異。從腸吸收動力學(xué)角度揭示方劑配伍的科學(xué)本質(zhì)。

1 實驗材料

1.1 儀器

BT01－DG2蠕動泵(天津市協(xié)達偉業(yè)電子有限公司);Shimadzu LC－20AT高效液相色譜儀;SPDM20A二極陣列管檢測器;恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠);RE－2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);TG1650－WS離心機(上海盧湘儀)。

1.2 藥品及試劑

吳茱萸藥材(廣州和翔制藥有限公司，批號:121001，產(chǎn)地:貴州);吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110802－200606);吳茱萸次堿標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110801－201006);五味子提取物(實驗室自制，木質(zhì)素含量);維拉帕米(VP，廣州市齊云生物技術(shù)有限公司);酚紅(天津市福晨化學(xué)試劑廠);十二烷基硫酸鈉(SDS，天津市福晨化學(xué)試劑廠);牛血清白蛋白(BSA，Genbase Bioscience Co.);烏來糖(上海潤捷化學(xué)試劑有限公司)。乙腈為色譜純，其余試劑均為分析醇。

1.3 動物

健康SD大鼠，♂，體重(250±30)g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供［實驗動物衛(wèi)生許可證號:SCXK(粵)2008－0020］。

2 方法與結(jié)果

2.1 吳茱萸提取物的制備

精密稱取吳茱萸藥材100g，用10倍量80%的乙醇加熱回流三次，每次3小時。合并提取液，靜置過濾，減壓濃縮至無醇味，離心取沉淀，真空干燥后備用。

2.2 試液配制

2.2.1 Krebs－ Ringer，s(K － R) 稱取 NaCl 7.8g，KCl 0.35g，CaCl20.37g，NaHCO31.37g，NaH3PO40.32g，MgCl20.02g，葡萄糖1.4g，蒸餾水定容至1L，即得到PH7.4的K－R液。

含BSA的 K－R液:精密稱取 BSA 4g，置于100mL容量瓶中，加K－R液溶解，稀釋定容至刻度，搖勻，得到含4%BSA的K－R液。

酚紅K－R液:精密稱取酚紅20mg，置1 000mL容量瓶中，加K－R液溶解，稀釋定容至刻度，搖勻，得到濃度為20μg/mL的酚紅K－R液。

含BSA的酚紅K－R液:精密稱取BSA 4g，置于100mL容量瓶中，加酚紅K－R液溶解，稀釋定容至刻度，搖勻，得到含4%BSA的酚紅K－R液。

2.2.2 腸循環(huán)液 精密稱取吳茱萸醇提物100mg，置于100mL容量瓶中，加入1mLDMSO超聲溶解后，稱取BSA 4g加入其中，然后加入酚紅K－R液，超聲溶解，并室溫稀釋定容到刻度，搖勻，使吳茱萸醇提物的濃度為1mg/mL。

2.2.3 加五味子提取物的腸循環(huán)液 分別稱取吳茱萸醇提物100mg于3支100mL容量瓶中，各加入50，100，200mg的五味子提取物，分別加入1mL DMSO超聲溶解后，各稱取BSA 4g加入其中，然后加入酚紅K－R液，超聲溶解，并室溫稀釋定容到刻度，搖勻即得。

2.2.4 加P－gp抑制劑的腸循環(huán)液 稱取吳茱萸醇提物100mg于100mL容量瓶中，加1mL DMSO超聲溶解后，稱取4g BSA加入其中，然后加入酚紅K－R液，超聲溶解，再加入維拉帕米(0.1mg·mL－1)，超聲溶解后用酚紅K－R液室溫定容到刻度，搖勻即得。

2.3 腸循環(huán)灌流液中藥物濃度的測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18色譜柱(250mm ×4.6mm);Phenomenex C18預(yù)柱;流動相:乙腈 － 水(49∶51);流速:1.0mL/分，檢測波長:吳茱萸堿225nm，吳茱萸次堿 345nm;進樣量:20μL，柱溫:25℃。

2.3.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取吳茱萸堿、吳茱萸次堿標(biāo)準(zhǔn)品 2.16，2.62mg，置于 50mL 容量瓶中，加入甲醇超聲溶解，放置室溫后用甲醇定容搖勻，為母液1。取0.5mL母液1置于2mL容量瓶中，加入含BSA的酚紅K－R液0.5mL后，加甲醇至刻度搖勻，然后渦旋1分鐘，沉淀過夜，次日取出6 000r離心20分鐘，取上清即得吳茱萸混合對照品母液。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取吳茱萸堿、吳茱萸次堿混合對照品母液適量，按數(shù)倍稀釋法，用KR溶液∶甲醇(1∶3，V/V)溶液稀釋，得到一系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。在上述色譜條件下進樣測定，記錄色譜數(shù)據(jù)，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程:吳茱萸堿Y=7.9×10－6X －0.0045，r=0.9999，線性范圍為2.1μg/mL ～10.8μg/mL;吳茱萸次堿 Y=1.7 ×10 －5X+0.0491，r=0.9999，線性范圍為 2.6μg/mL ～13.1μg/mL。吳茱萸堿、吳茱萸次堿的平均回收率分別為100.52%、99.38%，RSD 分別為 2.12%、1.98%。以上結(jié)果表明，吳茱萸堿和吳茱萸次堿在各自濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系并具較好的回收率。

圖1 HPLC圖譜

2.3.4 樣品的處理 精密吸取腸灌流液0.5mL，加1.5mL甲醇，渦旋混合1分鐘，放置冰箱沉淀過夜，次日6 000r/分鐘離心20分鐘，取上清液過0.45μm微孔濾膜。在上述色譜條件下進行分析。

2.3.5 精密度實驗 精密吸取對照品母液5μL，連續(xù)進樣6次，測定吳茱萸兩堿的峰面積值，其RSD為0.18%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 用空白腸循環(huán)液配1mg/mL的吳茱萸醇提物溶液，置37℃水浴鍋中，并于0，2，4，6h測定溶液中的吳茱萸兩堿含量，其RSD值為0.52%(n=7)，顯示吳茱萸醇提物中2種有效成分在空白腸循環(huán)液中具有較好的穩(wěn)定性。

2.4 大鼠原位腸循環(huán)實驗

2.4.1 大鼠原位腸循環(huán)實驗方法［6］

取實驗前禁食12h(自由飲水)的SD大鼠，腹腔注射烏拉坦0.6mL/100g，麻醉后固定。沿腹中線打開腹腔(約2.5cm)，結(jié)扎膽總管，在實驗?zāi)c管兩端各切一小口，在上端小口處插入直徑為0.3cm的玻璃管，并用線扎緊。用注射器將37±0.5℃的生理鹽水緩緩注入腸管，洗去腸管內(nèi)容物至凈。然后在實驗?zāi)c管下端小口處插入玻璃管，并用線扎緊。將腸管兩端的玻璃管與蠕動泵的膠管連接，形成回路，開動蠕動泵。以5mL/分流速循環(huán)10分鐘后，將流速調(diào)節(jié)為2.5mL/分，立即自裝有灌注液的錐形瓶中取樣lmL，作為測定零時間藥物濃度和酚紅濃度的樣品，另向錐形瓶中補加酚紅K－R液lmL，其后每隔20分鐘亦按同法取樣并補加酚紅K－R液，循環(huán)3小時后，中止實驗。

2.4.2 原位腸灌流實驗法中參數(shù)計算［7］

以小腸內(nèi)剩余藥量的對數(shù)(lnX)對取樣時間t作圖，由直線斜率求出吸收速率常數(shù)Ka(h－1)∶Ka=(InX0－InX)/t。剩余藥量 X=CV(C為測得的藥物濃度，V為相應(yīng)時間的循環(huán)液體積)。表現(xiàn)滲透系數(shù)Papp:藥物透過胃腸道粘膜的表觀滲透系數(shù)Papp，單位為 cm/s。A為小腸吸收面積(cm2)。Papp=Ka/A/3600。

2.4.3 灌流液中酚紅濃度的測定

由于腸灌流的過程中不但有水的吸收，還有水的分泌，導(dǎo)致循液的體積發(fā)生變化，通過對酚紅濃度的測定來校正水的吸收。用空白腸灌流液加入酚紅配制一系列標(biāo)準(zhǔn)液，取上述不同濃度的酚紅溶液各0.5mL，加入 4.5mL，1.0mol/L 的 NaOH 溶液顯色，于400～800nm波長范圍內(nèi)進行掃描在558nm處酚紅有最大吸收，因此于558nm處測定酚紅的吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)(Y)、酚紅濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程:Y=4.4596X －0.0396，r=0.9988，線性范圍為 8.88μg/mL ～31.08μg/mL，RSD 為2.31，平均回收率為100.56%。

2.5 實驗結(jié)果

2.5.1 P－gp抑制劑對吳茱萸總生物堿腸吸收的影響

按照“2.2.2”配制濃度為 1mg/mL 吳茱萸醇提物作為對照組溶液，另取1mg/mL吳茱萸醇提物溶液加入維拉帕米(0.1mg/mL)作為維拉帕米組溶液。取SD大鼠10只，按照“2.4.1”的實驗步驟進行原位腸循環(huán)灌注，定時取樣，測定各時間點的吳茱萸堿、吳茱萸次堿的濃度，然后按照“2.4.2”計算其Ka、Papp，結(jié)果見表 1。

表1 P－gp抑制劑對吳茱萸生物堿腸吸收動力學(xué)參數(shù)(±s，n=5)

表1 P－gp抑制劑對吳茱萸生物堿腸吸收動力學(xué)參數(shù)(±s，n=5)

吳茱萸堿 吳茱萸次堿維拉帕米 Ka 0.727 ±0.027 0.674 ±0.016 Papp×10－6cm·s－11.251 ±0.021 1.163 ±0.051對 照Ka 0.482 ±0.019 0.411 ±0.010 Papp×10－6cm·s－10.894 ±0.106 0.731 ±0.064

2.5.2 不同濃度五味子提取物對吳茱萸生物堿腸吸收研究

按照“2.2.3”分別配制加高、中、低濃度五味子提取物的腸流液作為供試品溶液。取SD大鼠15只，隨機分成三組，按照“2.4.1”的實驗步驟進行原位腸循環(huán)灌注，定時取樣，測定各時間點的吳茱萸堿、吳茱萸次堿的濃度，然后按照“2.4.2”計算其Ka、Papp，結(jié)果見表 2。

表2 不同濃度五味子提取物對吳茱萸生物堿腸吸收動力學(xué)參數(shù)(±s，n=5)

表2 不同濃度五味子提取物對吳茱萸生物堿腸吸收動力學(xué)參數(shù)(±s，n=5)

吳茱萸堿 吳茱萸次堿五味子低劑量組 Ka 0.756 ±0.025 0.663 ±0.021 Papp×10－6cm·s－11.208 ±0.109 1.062 ±0.046五味子中劑量組Ka 0.771 ±0.030 0.625 ±0.020 Papp×10 －6cm·s－1 1.345±0.091 1.092±0.088五味子高劑量組Ka 0.774 ±0.020 0.623 ±0.023 Papp×10 －6cm·s－1 1.131±0.135 0.922±0.107對照組Ka 0.482 ±0.019 0.411 ±0.010 Papp×10－6cm·s－10.894 ±0.106 0.731 ±0.064

由以上各表可知，加入P－gp抑制劑維拉帕米(VP)與正常組相比，吳茱萸堿和吳茱萸次堿的吸收速率常數(shù)(Ka)和表觀滲透系數(shù)(Papp)都顯著增加(P＜0.05)。這種吸收促進作用是通過抑制P－gp外排而起作用的，提示吳茱萸堿、吳茱萸次堿可能是P－gp底物。加入五味子提取物與正常組相比，吳茱萸堿和吳茱萸次堿的吸收速率常數(shù)(Ka)和表觀滲透系數(shù)(Papp)都顯著增加(P＜0.05);但在考察的五味子濃度范圍以內(nèi)，高中低濃度組組間對比，吸收速率常數(shù)(Ka)和表觀滲透系數(shù)(Papp)卻沒有顯著差異(P ＞0.05)。

3 討論

小腸是口服藥物的主要吸收部位，藥物的腸吸收在一定程度上能夠反映口服后的整體吸收情況。大鼠原位腸灌流模型能夠反映腸道的真實環(huán)境，排除肝臟的首過效應(yīng)和藥物在腸壁組織中的代謝等生物轉(zhuǎn)化，與人體實驗相關(guān)性良好［8－9］，并且具有良好的可操控性，簡便，快速，準(zhǔn)確，在國內(nèi)外藥物研究中已得到廣泛應(yīng)用。但該法也有局限性，藥物必須以水溶液狀態(tài)存在。吳茱萸中的Evo和Rut水溶性均不好，因此考慮加入BSA，起到助溶作用。

目前關(guān)于五味子和吳茱萸的相互作用機制方面的研究不是很多，有文獻報道［10－11］吳茱萸某些成分可能為P－gp底物。通過本實驗結(jié)果初步推測五味子有效成分［12］和吳茱萸兩堿可能都為P－gp底物，在大鼠小腸，五味子提取物競爭性作用于P－gp，從而抑制了P－gp對吳茱萸兩堿的外排作用。加入P－gp抑制劑組吳茱萸兩堿的吸收有所增加，與文獻報道的結(jié)果不相符［13］，可能是由于所用模型不一樣所致。大鼠原位腸灌流實驗操作雖然簡單，但隨機因素太多，還需用細胞吸收模型進一步確證。

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