★ 錢秋海＊＊ 錢衛(wèi)斌 郭春芳 蔡欣蕊 姜群群 馮曉 (.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科

濟南250011;2.日本鳥取大學(xué)醫(yī)學(xué)部 鳥取683－8503;3.山東省禹城市人民醫(yī)院 禹城251200;4.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 濟南250014)

糖尿病脂肪肝是嚴(yán)重影響糖尿病患者身體健康的常見病，以糖尿病和肝臟結(jié)構(gòu)異常并存為主要臨床特征。近年來，隨著糖尿病發(fā)病率的急劇增高，糖尿病脂肪肝的發(fā)病率顯著增高。糖尿病脂肪肝一旦發(fā)生，既可出現(xiàn)肝臟脂肪沉積、肝功能異常，又會增加胰島素抵抗，使糖尿病更難控制。本研究應(yīng)用電鏡和光鏡觀察糖肝康對肝臟組織病理及超微結(jié)構(gòu)的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 實驗材料

1.1 動物及飼料

健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)試驗動物中心提供，動物合格證號:SCXR(魯)2005015;常規(guī)飼料由山東省實驗動物中心提供;高糖高脂飼料(清潔級)由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供(配方:10.0%豬油，20.0%蔗糖，10.0% 蛋黃粉，0.5% 膽酸鈉和 59.5% 常規(guī)飼料)。

1.2 藥品及試劑

1.2.1 觀察用藥

糖肝康由生黃芪、白術(shù)、茵陳、黃芩、柴胡、炒梔子、丹參、大黃等藥物組成(由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房提供，實驗時制成糖肝康濃縮煎劑，濃度為1.87g/mL 及 3.75g/mL。

1.2.2 對照用藥 降糖甲片，由吉林敖東制藥有限公司提供，生產(chǎn)批號:090314。給藥時配成降糖甲混懸液，濃度約5.6g/mL。

1.2.3 動物模型用藥 鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ):由美國Sigma公司生產(chǎn)，北京博愛港商貿(mào)有限公司提供。

1.3 實驗儀器

電子天平(上海天平儀器廠);LXJ－Ⅱ型離心沉淀機(上海第二分析儀器廠);美國強生血糖分析儀(武漢綠森林科技發(fā)展有限公司);LG－10A高速冷凍離心機(日立公司);γ免疫計數(shù)儀(西安二六二廠);Reichert－Jung超薄切片機，由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供;日本電子(JEOL)JEM－1200EX透射電鏡，由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。

2 實驗方法

2.1 造模方法

SD大鼠50只，給予普通飼料、自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，改高糖高脂飼料喂養(yǎng)，6周后，禁食l2小時，斷尾取血并用美國強生血糖儀測空腹血糖。按30mg/kg體重的劑量腹腔內(nèi)注射新鮮配制的2%鏈脲佐菌素(檸檬酸緩沖液，pH4.2)。72小時后尾靜脈取血測血糖，血糖高于16.7mmol/L者確定為糖尿病模型制作成功。選取40只大鼠進入實驗。

2.2 分組及給藥

將40只糖尿病大鼠隨即分為4組(n=10):(1)模型對照組，(2)糖肝康小劑量組，(3)糖肝康大劑量組，(4)降糖甲對照組，每組10只。其中，模型對照組給予生理鹽水10mL/kg灌胃;糖肝康小劑量組給予濃度為1.87g/mL的糖肝康灌胃;糖肝康大劑量組給予濃度為3.75g/mL的糖肝康灌胃;降糖甲對照組給予降糖甲混懸液56g/kg灌胃。實驗各組均給藥容積為10mL/kg，每日灌胃一次，高脂飼料飲食，正常飲水。另取10只正常大鼠作為正常對照組，每日10mL/kg生理鹽水灌胃，并予正常飼料飲食，正常飲水。室溫18－20℃，12小時交替照明。連續(xù)給藥12周。

2.3 標(biāo)本采集

上述大鼠給藥12周后，給動物腹腔注射戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉，迅速剖腹，并在冰盒上截取大鼠肝臟1mm3組織置于3%戊二醛中固定，4℃條件保存，備測大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)。另取部分肝臟組織塊以4%中性甲醛溶液，備測肝臟病理變化。

2.4 鏡下觀察

病理標(biāo)本的制作:將肝臟組織4%中性甲醛溶液固定24小時，經(jīng)各級酒精脫水，石蠟包埋，切片后HE染色，光鏡下觀察肝臟病理結(jié)構(gòu)變化。

電鏡標(biāo)本的制作:將肝臟組織磷酸緩沖液沖洗，1%四氧化鋨酸固定1小時，三蒸水沖洗，用50%、70%、90%、100%丙酮逐級脫水，室溫下環(huán)氧樹脂(EPON)812包埋浸透過夜。UITRACUTE超薄切片機切片(厚約60－70nm)，鈾、鉛雙重染色，電子顯微鏡下進行肝臟超微結(jié)構(gòu)觀察。

3 實驗結(jié)果

實驗發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠肝臟外觀呈紅褐色，質(zhì)地軟而富有彈性，邊緣銳利。而模型組大鼠腹腔肥大，白色脂肪組織豐富，肝臟體積明顯增大，顏色黃白，切面油膩感，呈典型的脂肪病變。

光鏡下觀察顯示:正常組肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝細胞以中央靜脈為中心向四周呈放射狀整齊排列，肝細胞分界清，大小較一致，核1－2個，圓而清晰，核位于細胞中央，胞質(zhì)豐富，肝竇排列規(guī)則，匯管區(qū)清晰，無炎癥反應(yīng)。而模型組大鼠肝細胞胞質(zhì)內(nèi)充滿大量大小不等的圓形脂滴，呈嚴(yán)重的脂肪變性;脂滴位于胞核周圍或胞質(zhì)一側(cè)，將核擠向一邊，有的融合成大脂滴，將細胞核擠壓于細胞邊緣;脂肪變性以周邊帶(匯管區(qū))和中間帶為最重，嚴(yán)重者可波及小葉中央帶(中央靜脈區(qū))，肝小葉邊界不清，肝索排列紊亂，少數(shù)動物肝竇和中央靜脈有擴張現(xiàn)象，其間有紅細胞堆積，其余肝竇閉塞.而糖肝康大劑量組可見肝細胞內(nèi)脂肪變性明顯減少，僅有少量脂肪空泡，無明顯異型性，無核分裂性，肝小葉間纖維組織基本消失。降糖甲組的病變介于模型組和糖肝康大劑量組之間。如圖1所示。

圖1 糖肝康對糖尿病脂肪肝大鼠肝臟病理結(jié)構(gòu)的影響(×200)

電鏡下觀察顯示:正常對照組肝細胞的細胞核呈圓形或卵圓形，單核，胞漿中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較少。線粒體豐富，呈圓形或長圓形，內(nèi)嵴顯示清楚，偶見少數(shù)線粒體內(nèi)嵴模糊。胞漿中極少見脂滴分布，其直徑小于1μm;偶見膠原纖維增生。模型對照組:可見大量脂滴，大小不等，常3－5個成群，單個脂滴直徑可達5μm;細胞核不規(guī)則，有凹陷，核內(nèi)染色質(zhì)異常，異染色質(zhì)邊聚，常染色質(zhì)呈團塊狀;線粒體大小不一，分布不均勻，線粒體嵴模糊或空泛;部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹;可見膠原纖維增生。糖肝康大劑量組:超微結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，細胞核形狀基本規(guī)則，核周隙正常，偶可見核皺褶，染色質(zhì)分布均勻，無溶解;胞漿內(nèi)脂滴顯著減少;線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張均不明顯;可見少量膠原纖維增生。糖肝康小劑量組和降糖甲組肝細胞結(jié)構(gòu)無明顯差異，均介于模型對照組和糖肝康大劑量組之間。如圖2所示。

圖2 糖肝康對糖尿病脂肪肝大鼠超微結(jié)構(gòu)的影響

4 討論

糖尿病性肝病系指糖尿病引起的肝臟功能和組織學(xué)變化的病變，屬于糖尿病慢性并發(fā)癥范疇［1］。肝臟作為長期高血糖累及的靶器官之一，由于其代償功能較強、早期的肝臟損害常常不明顯等原因，糖尿病肝損害不容易引起人們的注意，胰島素抵抗的患者直到發(fā)生糖尿病、高血壓、高血脂以及血管疾病時才被發(fā)現(xiàn)肝損傷。而當(dāng)肝損害進展至后期，如肝硬化，病情往往己經(jīng)不可逆轉(zhuǎn)。近年來，隨著糖尿病發(fā)病率的急劇增高，糖尿病并發(fā)脂肪肝的發(fā)病率也有顯著增高的趨勢。據(jù)文獻報道糖尿病肝損害的發(fā)生率為10% －30%［2］。糖尿病脂肪肝的存在使糖尿病的治療難度加大，并直接影響糖尿病的療效和預(yù)后。因此，對糖尿病脂肪肝的研究，正在逐步引起醫(yī)學(xué)界的重視。

肝臟是胰島素作用的靶器官，也是脂肪代謝的重要器官。肝臟對脂肪的攝取、氧化、脂肪酸代謝、膽固醇的生成、磷脂和脂蛋白的合成和分泌起著中樞性作用。正常狀態(tài)下，脂類代謝在肝臟中保持著動態(tài)平衡。當(dāng)脂代謝紊亂時，大量脂肪從脂庫中動員分解出來，并且大部分進入肝細胞。肝內(nèi)脂肪的增加超過了肝細胞將其氧化利用和合成脂蛋白運輸出去的能力，則使肝細胞脂肪沉積及肝細胞變性，形成脂肪肝［3－4］。

我們根據(jù)中醫(yī)理論，并結(jié)合多年臨床經(jīng)驗認(rèn)為，糖尿病肝損傷雖有糖尿病和肝損傷兩種不同的表現(xiàn)，但因其發(fā)病于同一患者，且肝損傷是在糖尿病基礎(chǔ)上發(fā)生的，二者必然具有一定的內(nèi)在聯(lián)系，治療上應(yīng)將其看作一個整體，才能收到顯著的療效。因而提出本病為多虛多瘀之證，其主要病機是以脾氣虧虛為本，肝失調(diào)達、瘀毒互結(jié)為標(biāo)。治療上應(yīng)以健脾益氣治其本，調(diào)肝解毒活血治其標(biāo)為治則。并精心組方，研制了糖肝康方，由生黃芪、白術(shù)、茵陳、黃芩、柴胡、炒梔子、大黃、白芍等藥物組成，諸藥合用共奏健脾益氣、調(diào)肝解毒、清熱化濕活血之功。

本研究結(jié)果表明:以健脾益氣、調(diào)肝解毒活血為組方原則研制的糖肝康能有效的改善糖尿病脂肪肝大鼠肝臟組織的病理結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)，提示本方對糖尿病脂肪肝病變有顯著的防治作用，值得進一步推廣和研究。

［1］冼蘇.糖尿病肝病的研究現(xiàn)狀及進展［J］.廣西醫(yī)學(xué)，2004，26:918－920.

［2］沈稚舟，吳松華，邵福源.糖盡病慢性并發(fā)癥［M］.上海:上海醫(yī)科大學(xué)出版社，1999:321.

［3］Charltom M，Sreekumar R，Rasmussen D，et al.Apolipoprotein synthesis nonalcoholic steatohepatits［J］.Hepatology，2002，35:898 ～904.

［4］Horton JD，Goldstein JL，Brown MS.SREBPs:activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver［J］.J Clin Invest，2002，109:1 125 ～1 131.