李生軍 矯健 郭靜 孟凡東 赫寶雙 梁雪 隋波

隨著疫苗質(zhì)量要求越來越高, 國家食品藥品監(jiān)督管理局在2009年第6號公告“關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范生物制品質(zhì)量控制要求的通告”中已明文規(guī)定生物制品生產(chǎn)中應(yīng)盡可能避免使用抗生素。現(xiàn)許多企業(yè)生產(chǎn)疫苗都使用MEM培養(yǎng)基［1-3］。由于日水公司MEM中含有卡那霉素, 因此無抗生素培養(yǎng)基將被廣泛應(yīng)用。我們將?？寺」綧EM和日水MEM在細(xì)胞生長各個方面做了比較, 獲得較滿意的結(jié)果。

1 主要材料與設(shè)備

1.1 ?？寺EM培養(yǎng)基(不含卡那霉素)

批號： AWK22509DC

1.2 日水MEM培養(yǎng)基 批號：616609

1.3 太原潤生新生牛血清 批號： 100726100

1.4 胰酶 (美國 Becton Dickinson and Company)

1.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 (count star)

1.6 冰點(diǎn)滲透壓儀 (Advanced Instruments)

1.7 顯微成像系統(tǒng) (重慶光電)

2 方法

2.1 ?？寺∨囵B(yǎng)基配制, 取?？寺EM按9.5g/L加入到滅菌注射用水中, 攪拌均勻, 除菌過濾、分裝, 37℃保存。

2.2 日水培養(yǎng)基配制, 取日水MEM按9.4g/L加入到滅菌注射用水中, 攪拌均勻, 除菌過濾、分裝, 37℃保存。

2.3 細(xì)胞生長液配制, 為含10%新生牛血清的MEM液, pH值7.2～7.4, 滲透壓250～300 mOsmol/kg。

2.4 細(xì)胞復(fù)蘇 取出27代細(xì)胞2管, 速融, 分別用吸管吸至T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中, 補(bǔ)加生長液至30ml。37℃、CO2孵箱靜置培養(yǎng), 第二天換液, 繼續(xù)培養(yǎng)。

2.5 細(xì)胞生長情況實(shí)驗(yàn)

①2BS細(xì)胞傳代培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后, 鏡下觀察細(xì)胞生長情況及形態(tài)。

②細(xì)胞計(jì)數(shù):細(xì)胞單層后, 用胰酶消化細(xì)胞, 取20 μl細(xì)胞懸液到 20 μl臺盼藍(lán)中 , 混合均勻計(jì)數(shù)［4］。

3 結(jié)果

3.1 兩種MEM培養(yǎng)液的細(xì)胞貼壁、細(xì)胞形態(tài)、單層狀態(tài) 2BS細(xì)胞株在兩種MEM生長液中, 培養(yǎng)過程中顯微成像系統(tǒng)觀察比較細(xì)胞生長形態(tài)、貼壁、伸展、牽手、成網(wǎng)、單層等各生長階段相似, 均無顯著差異。72 h單層消化計(jì)數(shù),兩種MEM培養(yǎng)的T75瓶細(xì)胞數(shù)量均能達(dá)到1200萬個。

3.2 兩種MEM液細(xì)胞活性比較 相同條件下用?？寺　⑷账畠煞NMEM連續(xù)傳5代細(xì)胞, 總結(jié)兩種MEM對細(xì)胞活性的影響。每次單層傳代時分別取細(xì)胞懸液, 計(jì)數(shù)并記錄活細(xì)胞數(shù),記錄平均活細(xì)胞率, ?？寺』罴?xì)胞率為96.4%、96.3%、97.4%、97.1%、97.3% ；日水為96.3%、96.5%、97.2%、97.2%、97.4%。兩種MEM均能使細(xì)胞保持較高的活力, 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P>0.05,兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 討論

人胚肺2BS細(xì)胞在復(fù)蘇、傳代、生長過程中對培養(yǎng)基要求比較高, 其pH及滲透壓直接影響到細(xì)胞的貼壁、分裂及生長。經(jīng)過長期的實(shí)驗(yàn)分析, 2BS細(xì)胞在復(fù)蘇階段pH值要比傳代階段略低一些。這樣復(fù)蘇的細(xì)胞在貼壁、形態(tài)、分裂速度等方面都較為理想。在細(xì)胞連續(xù)傳代早期, 一般以1:2傳代比例為宜, 待細(xì)胞傳過兩代后, 方可轉(zhuǎn)至1:4傳代比例。胰酶消化細(xì)胞間隙的同時, 對細(xì)胞膜也有傷害作用, 消化時要注意控制好胰酶的活性, 防止細(xì)胞消化時細(xì)胞膜被破壞,直接影響細(xì)胞傳代生長。本實(shí)驗(yàn)在使用?？寺?、日水兩種MEM對2BS細(xì)胞的傳代培養(yǎng)過程中, 2BS細(xì)胞在貼壁、形態(tài)、分裂速度、單層數(shù)量等生長情況均無明顯差異, 均能保證2BS細(xì)胞正常生長。

［1］藥典委員會.中華人民共和國藥典.第三部，2010.

［2］劉燁, 李生軍, 李春明.凍干水痘減毒活疫苗轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝的建立.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展, 2004, 32(1):9.

［3］李建平, 周長軍, 王宇, 等.國產(chǎn)與進(jìn)口DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO-C2 8細(xì)胞效果比較.中國生物制品學(xué)雜志, 2007,20(3):219.

［4］郝鵬博, 杜巖, 謝秋紅, 等.比較胰酶/EDTA兩種消化液對攜帶水痘-帶狀皰疹病毒的2BS消化效果分析.中國實(shí)用醫(yī)藥,2011, 06(21):60-61.