盧錦標(biāo) 楊蕾 付麗麗 陳保文 都偉欣 王國(guó)治 徐苗

近幾年，結(jié)核新疫苗的發(fā)展非常迅速，國(guó)外進(jìn)入臨床Ⅰ期的已達(dá)13個(gè)，其中7個(gè)已進(jìn)入或通過(guò)臨床Ⅱ期［1］。這些新疫苗中，有5個(gè)屬于重組蛋白亞單位疫苗，由多種重組結(jié)核分枝桿菌特異性抗原和佐劑構(gòu)成，其設(shè)計(jì)者都選用各自研發(fā)的新型佐劑系統(tǒng)，通過(guò)增強(qiáng)疫苗的細(xì)胞免疫應(yīng)答，提高疫苗的免疫保護(hù)力。目前，國(guó)外已報(bào)告的結(jié)核疫苗用新型佐劑的有葛蘭素史克公司研發(fā)的AS01和AS02系列，丹麥國(guó)立血清研究院研發(fā)的IC31和CAF01，以及美國(guó)傳染病研究中心研發(fā)的GLA-SE［2］等。鑒于佐劑在結(jié)核重組蛋白亞單位疫苗的設(shè)計(jì)中發(fā)揮的關(guān)鍵作用，對(duì)促進(jìn)抗原細(xì)胞免疫至關(guān)重要，我室研發(fā)了以BCG為基礎(chǔ)的新型復(fù)合佐劑系統(tǒng)BC-C02［3］。前期研究中發(fā)現(xiàn)，該佐劑系統(tǒng)能提高抗原特異性IFN-γ分泌的脾淋巴細(xì)胞頻數(shù)，促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞特異性分泌IL-12［4］，毒理實(shí)驗(yàn)也證明該復(fù)合佐劑對(duì)動(dòng)物無(wú)不良反應(yīng)［3］。

除了佐劑，結(jié)核新疫苗的抗原選擇也很關(guān)鍵。結(jié)核分枝桿菌中已被證實(shí)具有免疫原性，可作為疫苗組分的蛋白有幾十種，其中最主要的一類(lèi)是分泌型蛋白，如 Ag85A、Ag85B、ESAT-6、CFP-10、MPT64等。Ag85A和Ag85B同源，免疫原性強(qiáng)，是目前已進(jìn)入臨床期候選疫苗中使用最頻繁的蛋白［1］。因在BCG中表達(dá)量低，無(wú)論作為替代現(xiàn)用BCG的初免用重組BCG，還是作為BCG加免用的病毒載體疫苗和重組蛋白亞單位疫苗，多選用此蛋白以提高保護(hù)力。另外，在BCG中缺失，而結(jié)核分枝桿菌獨(dú)有的RD-1區(qū)，對(duì)結(jié)核分枝桿菌的毒力維持起著重要作用，因此，該區(qū)域蛋白也成為結(jié)核新疫苗研究的熱點(diǎn)，其中代表性蛋白ESAT-6和CFP-10，常作為新疫苗的候選抗原，如已進(jìn)入臨床研究階段的重組蛋白亞單位疫苗 H1／IC31、H1／CAF01和 H56／IC31［5］，均含有ESAT-6抗原。

因此，本研究利用復(fù)合佐劑系統(tǒng)BC-C02，配伍重組蛋白Ag85B和ESAT6-CFP10融合蛋白（簡(jiǎn)稱(chēng)EC），構(gòu)建出新型結(jié)核亞單位疫苗AEC／BC-C02，并利用小鼠模型追蹤該疫苗誘導(dǎo)的長(zhǎng)期抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。

材料和方法

一、材料

1．材料和試劑：AEC／BC-C02 疫 苗 ［（10μg Ag85B＋10μg EC）／0．2ml BC-C02］由安徽龍科馬生物制藥有限責(zé)任公司提供。Ag85B和EC多肽庫(kù)（均15個(gè)氨基酸／條，重疊10個(gè)氨基酸）由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成。小鼠脾淋巴細(xì)胞分離液和小鼠IFN-γ預(yù)包被ELISA試劑盒購(gòu)自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。1640培養(yǎng)基，胎牛血清（FBS）和雙抗（青霉素和鏈霉素）購(gòu)自Thermo公司（美國(guó)）。小鼠IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（ELISPOT）試劑盒購(gòu)自Mabtech公司（瑞典）。Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。

2．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)BALB／c雌鼠，6～8周齡，由中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：scxk（京）2009-0017。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中飼養(yǎng)于中國(guó)食品藥品檢定研究院清潔級(jí)動(dòng)物房。均達(dá)到二級(jí)動(dòng)物房標(biāo)準(zhǔn)。

二、方法

1．小鼠免疫：6～8周齡SPF級(jí)BALB／c雌鼠48只，按數(shù)字表法隨機(jī)分成兩組，一組免疫結(jié)核亞單位疫苗AEC／BC-C02，為疫苗組；另一組免疫PBS，為PBS組。兩組均大腿內(nèi)側(cè)肌內(nèi)注射，0．2ml／只，共3針，間隔10d。末次免疫后第1、2、4、8周分別取兩組小鼠（6只／組）分離脾淋巴細(xì)胞，進(jìn)行抗原特異性的IFN-γELISPOT檢測(cè)，同時(shí)在末次免疫后第2、4、8周進(jìn)行IFN-γELISA檢測(cè)，第4、8周進(jìn)行抗原特異性的淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)。

2．IFN-γ的ELISPOT檢測(cè)：檢測(cè)當(dāng)日，摘眼球放血處死小鼠后，無(wú)菌取脾，分離淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2．5×106／ml。在已包被抗體的ELISPOT 96孔板中加入細(xì)胞，100μl／孔，分別添加50μl Ag85B多肽庫(kù)或EC多肽庫(kù)作刺激源，或50μl 1640完全培養(yǎng)基作陰性對(duì)照，或50μl ConA作陽(yáng)性對(duì)照。Ag85B多肽庫(kù)的終濃度為2μg·ml-1·條-1，EC多肽庫(kù)終濃度為3．5μg·ml-1·條-1。ConA陽(yáng)性對(duì)照為單孔，終濃度0．5μg／ml，其他刺激源和陰性對(duì)照均做復(fù)孔。37℃、5%CO2全濕潤(rùn)培養(yǎng)約48h后，按照ELISPOT試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ斑點(diǎn)形成細(xì)胞（spot forming cells，SFC）。

3．IFN-γ的ELISA檢測(cè)：利用制備的脾淋巴細(xì)胞（濃度2．5×106／ml）。在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入400μl／孔，再分別添加50μl Ag85B多肽庫(kù)或EC多肽庫(kù)作刺激源，或50μl 1640完全培養(yǎng)基作陰性對(duì)照。同時(shí)另取部分組細(xì)胞加入50μl／孔ConA作陽(yáng)性對(duì)照。Ag85B多肽庫(kù)的終濃度為2μg·ml-1·條-1，EC多肽庫(kù)終濃度為3．5μg·ml-1·條-1，ConA終濃度1μg／ml。37℃、5%CO2全濕潤(rùn)培養(yǎng)約66h后，按照IFN-γELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的濃度。

4．脾淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)：利用制備的脾淋巴細(xì)胞（濃度2．5×106／ml）。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入細(xì)胞，50μl／孔，分別添加50μl Ag85B多肽庫(kù)或EC多肽庫(kù)作刺激源，或50μl 1640完全培養(yǎng)基作陰性對(duì)照。同時(shí)另取部分組細(xì)胞加入50μl ConA作陽(yáng)性對(duì)照。取一孔，加入100μl不含細(xì)胞的1640培養(yǎng)基，作為空白對(duì)照。Ag85B多肽庫(kù)的終濃度為3μg·ml-1·條-1，EC多肽庫(kù)終濃度為5．25μg·ml-1·條-1，ConA終濃度0．5μg／ml。陰性對(duì)照做復(fù)孔，其他刺激源均做3孔。37℃、5%CO2全濕潤(rùn)培養(yǎng)約66h后，用CCK-8試劑盒檢測(cè)：WST-8［2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2，4-二磺基苯）-2H-四唑單鈉鹽］用1640培養(yǎng)基稀釋一倍后，20μl／孔加入，繼續(xù)培養(yǎng)2～8h，450／630nm檢測(cè)吸光度值A(chǔ)。刺激指數(shù)（stimulation index，SI）＝刺激孔A450／A630nm／陰性對(duì)照孔 A450／A630nm。A 值均為扣除空白對(duì)照孔讀數(shù)后的平均值。

5．?dāng)?shù)據(jù)分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)果作圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析在GraphPad Prism 5（美國(guó)，GraphPad Software公司）軟件中進(jìn)行，均采用成組或配對(duì)的雙側(cè)t檢驗(yàn)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、抗原特異性IFN-γ的ELISPOT檢測(cè)

末次免疫后的第1、2、4、8周，Ag85B多肽刺激后SFC 為 168．8±103．5、205．2±51．0、206．8±65．3和160．0±67．9，均分別高于 PBS對(duì)照組的8．9±6．0、16．1±18．8、9．3±4．9和7．7±6．6，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（成組t檢驗(yàn)，t值分別為3．779、8．525、7．424、5．473，P 值均＜0．01）；EC多肽刺激的SFC為45．1±18．6、75．6±39．3、86．2±50．4和54．3±26．3，均分別高于PBS對(duì)照組的4．5±3．5、11．7±10．5、3．8±5．8和5．2±4．3，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （成組t檢驗(yàn)，t值分別為 5．258、3．850、3．977、4．521，P 值均＜0．01），具體見(jiàn)圖1。

圖1 末次免疫后第1、2、4、8周檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞在刺激下特異性IFN-γ的ELISPOT檢測(cè)情況

末次免疫后的第1、2、4、8周，Ag85B多肽刺激的SFC均分別高于EC多肽刺激的SFC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（配對(duì)t檢驗(yàn)，分別為：t＝3．475，P＜0．05；t＝7．111，P＜0．01；t＝4．344，P＜0．01；t＝4．543，P＜0．01），具體見(jiàn)圖2。

圖2 末次免疫后的第1、2、4、8周，Ag85B多肽刺激與EC多肽刺激SFC的比較

二、抗原特異性IFN-γ的ELISA檢測(cè)

圖3 末次免疫后第2、4和8周脾淋巴細(xì)胞在不同刺激源刺激下特異性IFN-γ的ELISA檢測(cè)結(jié)果

免疫3針后第2、4和8周時(shí)，檢測(cè)疫苗組小鼠脾淋巴細(xì)胞體外刺激的抗原特異性IFN-γ釋放。如圖3，PBS組小鼠幾乎檢測(cè)不到抗原特異性的IFN-γ分泌，均在試劑盒檢測(cè)下限以下。而對(duì)疫苗組，Ag85B和EC多肽均能誘導(dǎo)較強(qiáng)的IFN-γ釋放，其中Ag85B多肽刺激的IFN-γ分泌量分別是（1．27±0．13）ng／ml，（1．76±0．55）ng／ml和（1．44±0．44）ng／ml；EC多肽刺激的IFN-γ分泌量分別是（0．81±0．33）ng／ml，（0．81±0．69）ng／ml和（0．54±0．29）ng／ml。同時(shí)，Ag85B多肽比EC多肽能刺激更高的IFN-γ分泌量，兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（配對(duì)t檢驗(yàn)，分別為：t＝3．008，P＜0．05；t＝2．631，P＜0．05；t＝10．02，P＜0．01）。

三、脾淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)

免疫3針后，于第4、8周，檢測(cè)疫苗組小鼠脾淋巴細(xì)胞在Ag85B多肽和EC多肽刺激下的增殖。末次免疫后的第4、8周，Ag85B多肽對(duì)疫苗組小鼠脾淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)（SI）分別為1．756±0．339和1．936±0．287，均分別高于 PBS組的1．287±0．0581和1．382±0．114，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（成組t檢驗(yàn)，分別為：t＝3．030，P＜0．05；t＝4．387，P＜0．01）；EC多肽對(duì)疫苗組的 SI值分別為1．599±0．154和 1．581±0．156，均分別高于 PBS 組的1．380±0．126和1．314±0．170，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（成組t檢驗(yàn)，t值分別為2．540、2．844，P 值均＜0．05）。同一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，Ag85B多肽刺激的SI平均值均高于EC多肽刺激的SI平均值，但這兩者之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（配對(duì)t檢驗(yàn)，第4周：t＝1．705，P＞0．05；第8周：t＝2．346，P＞0．05），具體見(jiàn)圖4。

討 論

結(jié)核病的免疫機(jī)制主要由T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫發(fā)揮作用，結(jié)核抗原的體液免疫應(yīng)答對(duì)抗結(jié)核基本無(wú)保護(hù)作用。在結(jié)核新疫苗的研究中，一般認(rèn)為，疫苗接種后誘導(dǎo)的抗原特異性多功能T細(xì)胞能有效控制結(jié)核分枝桿菌的感染或延遲結(jié)核病的發(fā)作，其中Th1類(lèi)細(xì)胞因子，如IFN-γ，TNF-α等，發(fā)揮著關(guān)鍵作用［6］。因此，在結(jié)核新疫苗的臨床前或臨床研究中，多偏重于考察疫苗的細(xì)胞免疫應(yīng)答［7-10］。

圖4 末次免疫后第4周和8周脾淋巴細(xì)胞不同刺激源刺激下的脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)

鑒于此，筆者對(duì)結(jié)核亞單位疫苗AEC／BC-C02在小鼠模型中進(jìn)行了以IFN-γ為代表的細(xì)胞免疫應(yīng)答評(píng)價(jià)。BALB／c小鼠免疫3針后，第1周ELISPOT法即可檢測(cè)到抗原特異性的IFN-γ表達(dá)，第2周和第4周SFC呈上升趨勢(shì)，至第8周下降，但抗原特異性SFC，仍維持在較高水平。這表明，結(jié)核亞單位疫苗AEC／BC-C02免疫3針后，可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性記憶T細(xì)胞，至第8周，仍能檢測(cè)到Ag85B和EC特異性的IFN-γ分泌T細(xì)胞，這些持續(xù)存在的特異性記憶T細(xì)胞對(duì)機(jī)體控制結(jié)核分枝桿菌的感染有重要意義。同時(shí)4次的檢測(cè)結(jié)果均顯示Ag85B多肽誘導(dǎo)的SFC數(shù)多于EC多肽誘導(dǎo)的，這表明Ag85B免疫原性好于EC，可誘導(dǎo)更強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。此外，IFN-γ的ELISA檢測(cè)結(jié)果和脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示，至末次免疫后第8周，疫苗組小鼠脾淋巴細(xì)胞的特異性IFN-γ分泌量和刺激指數(shù)都高于同一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的PBS組，這也印證了抗原特異性記憶T細(xì)胞持續(xù)存在的結(jié)論，與ELISPOT結(jié)果一致。需要指出，在IFN-γ的體外檢測(cè)中，筆者運(yùn)用了ELSPOT和ELISA兩種檢測(cè)方法。作為ELISA的改良技術(shù)，ELISPOT更靈敏，結(jié)果更直觀，后續(xù)操作較簡(jiǎn)單，已成為許多研究者的首選，但ELISPOT需要配套專(zhuān)門(mén)的且價(jià)格昂貴的讀板儀器，一定程度上限制了在基層的應(yīng)用。而ELISA技術(shù)成熟，相應(yīng)的酶標(biāo)儀非常普遍。從筆者使用這兩種方法的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，ELSPOT和ELISA檢測(cè)結(jié)果都能很好地反映抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答的走勢(shì)和Ag85B和EC兩種抗原的免疫原性差異，因此，在評(píng)價(jià)該疫苗的細(xì)胞免疫應(yīng)答時(shí)，如果不必檢測(cè)分泌抗原特異性細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率，僅定量檢測(cè)細(xì)胞因子分泌量，選擇ELISA即可。

總之，本研究中的結(jié)核亞單位新疫苗在小鼠模型中可誘導(dǎo)穩(wěn)定的抗原特異性記憶T細(xì)胞，產(chǎn)生有利于抗結(jié)核的細(xì)胞免疫應(yīng)答。目前，該疫苗對(duì)結(jié)核分枝桿菌敏感動(dòng)物豚鼠的抗結(jié)核作用正在驗(yàn)證中，初期實(shí)驗(yàn)效果良好。因此，本研究結(jié)果可為疫苗的免疫保護(hù)力效果提供藥理學(xué)依據(jù)。由于時(shí)間關(guān)系，本研究對(duì)疫苗末次免疫后8周內(nèi)的細(xì)胞免疫應(yīng)答僅進(jìn)行了一種細(xì)胞因子的檢測(cè)，其他Th1因子應(yīng)答，多功能T細(xì)胞亞群分析，以及更長(zhǎng)時(shí)間后的應(yīng)答水平等將有利于全面了解該疫苗的細(xì)胞免疫機(jī)制，這些還需進(jìn)一步研究。

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