谷大偉， 馬 莉

(貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550004)

白血病是造血干/祖細(xì)胞于分化過程的不同階段發(fā)生分化阻滯、凋亡障礙和惡性增殖而引起的一組異質(zhì)性的造血系統(tǒng)惡性腫瘤［1］。白血病在世界范圍內(nèi)的日漸高發(fā)且趨于低齡化也引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注，大量研究表明白血病的發(fā)生與癌基因的激活、抑癌基因的失活及細(xì)胞凋亡受抑有關(guān)［2］。生存素(survivin)又名存活素，是凋亡抑制蛋白家族中迄今為止最強(qiáng)的凋亡抑制因子［3］。survivin大量表達(dá)于胚胎及嬰幼兒組織中，正常組織中只有少量表達(dá)，而在60余種腫瘤細(xì)胞株和大部分人體腫瘤組織中過度表達(dá)［4-7］，也包括白血病細(xì)胞系［8］。白細(xì)胞分化抗原34(CD34)是造血干細(xì)胞或(和)祖細(xì)胞的特異性標(biāo)志，正常人骨髓中只有少量CD34+細(xì)胞，約占單個(gè)核細(xì)胞的1.0%～4.0%［9］，在急性髓系白血病(AML)細(xì)胞上則有較高頻率的表達(dá)。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為AML中CD34的表達(dá)與AML的低緩解率及短生存期有關(guān)，僅少數(shù)學(xué)者認(rèn)為CD34+AML與CD34－AML病例的緩解率、無病生存期無差異［10］。而關(guān)于AML患者骨髓細(xì)胞survivin基因與CD34共表達(dá)的研究鮮見報(bào)道。我們利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓細(xì)胞中survivin和CD34的表達(dá)，探討二者對(duì)白血病發(fā)生、發(fā)展的影響，從而為白血病的診療提供新思路、新方法。

材料和方法

一、對(duì)象

1.AML組 選取2010年4月至2011年1月貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液科收治的AML患者共62例，所有病例經(jīng)臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查確診，符合世界衛(wèi)生組織(WHO)診斷標(biāo)準(zhǔn)及英美法協(xié)作組(FAB)診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］。其中男28例、女34例，年齡19～60歲。62例AML患者根據(jù)治療后是否緩解分組。(1)治療未緩解組:38例，確診后經(jīng)過2～4個(gè)月的臨床治療未達(dá)到目前公認(rèn)的完全或部分緩解標(biāo)準(zhǔn)［1］;(2)治療緩解組:24例，確診后經(jīng)過2～4個(gè)月的臨床治療達(dá)到目前公認(rèn)的完全或部分緩解標(biāo)準(zhǔn)［1］。

2.對(duì)照組 2010年4月至2011年1月貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液科收治的非惡性血液病患者31例(包括缺鐵性貧血13例、特發(fā)性血小板減少性紫癜3例、傳染性單核細(xì)胞增多癥5例、骨髓未見明顯異常10例)，其中男13例、女18例，年齡23～59歲。所有病例經(jīng)臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查確診，且采集標(biāo)本時(shí)未接受任何臨床治療。

二、方法

1.標(biāo)本采集 髂前或髂后上棘部位進(jìn)行穿刺抽取骨髓液1 mL，立即置于含有2 mL肝素抗凝劑的生化管中，輕輕上下顛倒搖勻，避免骨髓液凝固，立即送檢。

2.儀器與試劑 儀器為FACS-Calibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。白血病免疫分型試劑［CD45-Percp、CD10-異硫氰酸熒光素(FITC)、CD19-藻紅蛋白(PE)、CD20-FITC、CD5-PE、CD2-FITC、CD22-PE、CD7-FITC、CD33-PE、CD15-FITC、CD11b-PE、CD34-FITC、CD14-PE、HLA-DR-FITC、CD13-PE、IgG1-FITC/IgG2a-PE;survivin檢測(cè)抗體Survivin-Alexa Fluor488］由美國BD公司和美國Cell Signaling公司提供的。

3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 取100μL骨髓標(biāo)本，分別加入各熒光標(biāo)記抗體20μL，充分混勻后室溫(15～22℃)避光孵育20 min;再加入10×紅細(xì)胞裂解液1 mL，混勻后室溫(15～22℃)避光8 min，再加入磷酸鹽緩沖液(PBS)1 mL，1 000×g離心5 min，棄上清，重復(fù)1次;棄上清，加入適量PBS充分混勻，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。運(yùn)行FACSComp軟件，以BD三色流式細(xì)胞儀定標(biāo)試劑定標(biāo)，調(diào)節(jié)電壓及補(bǔ)償于最佳狀態(tài)，使用CELLQuest軟件進(jìn)行免疫分型及 survivin檢測(cè)分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析和組間多重比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表中各組數(shù)據(jù)多重比較前均進(jìn)行了單樣本的K-S檢驗(yàn)和獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，確定各組數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布且具方差齊性(P＜0.01)。

結(jié) 果

一、各組survivin+/CD34+雙表達(dá)分析

AML治療未緩解組survivin+/CD34+雙表達(dá)和survivin+/CD34－表達(dá)均明顯高于AML治療緩解組和非惡性血液病組(P＜0.01、P＜0.05)，而非惡性血液病組和AML治療緩解組survivin+/CD34+雙表達(dá)和survivin+/CD34－表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1、圖1。

表1 各組survivin+/CD34+雙表達(dá)和survivin+/CD34－表達(dá)比較(±s)

表1 各組survivin+/CD34+雙表達(dá)和survivin+/CD34－表達(dá)比較(±s)

注:與AML 治療未緩解組比較，*P＜0.05、＊＊P＜0.01

AML 治療緩解組 24 4.06±1.41# 14.32±7.53*

圖1 各實(shí)驗(yàn)組survivin及CD34+表達(dá)情況

二、AML治療未緩解組survivin+/CD34+雙表達(dá)和survivin+/CD34－表達(dá)的分析

AML各亞型間存在抗體表達(dá)的差異，特別是AML-M3型白血病特征性的不表達(dá)CD34。本研究將這一特點(diǎn)結(jié)合survivin的表達(dá)及分析數(shù)據(jù)將AML治療未緩解組進(jìn)一步分為survivin+/CD34+雙表達(dá)較高的A組(22例)、有survivin+/CD34+雙表達(dá)也有survivin+/CD34－表達(dá)的B組以及 survivin+/CD34－表達(dá)較高的C組，見圖2～4，比較3組間survivin+/CD34表達(dá)的差異。C組survivin+/CD34+雙表達(dá)明顯低于A組和B組(P＜0.01、P＜0.05)，而 A 組與B組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。A組survivin+/CD34－表達(dá)明顯低于B組和C組(P＜0.01)，而 B組和C組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

圖2 survivin+/CD34+雙表達(dá)較高的A組

圖3 survivin+/CD34+雙表達(dá)和survivin+/CD34－表達(dá)的B組

圖4 survivin+/CD34－表達(dá)的C組

表2 AML治療未緩解組3亞組間survivin+/CD34+雙表達(dá)和survivin+/CD34－表達(dá)的比較(±s)

表2 AML治療未緩解組3亞組間survivin+/CD34+雙表達(dá)和survivin+/CD34－表達(dá)的比較(±s)

注:與A 組比較，*P＜0.01，與B 組比較，#P＜0.05

組 54.38±16.88 C 組 8 2.93±3.55*# 57.53±25.10*

討 論

survivin屬于凋亡抑制蛋白(Inhibitorofapoptosis，IAP)家族，具有抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期的作用，廣泛表達(dá)于人體的各種腫瘤組織中，通過直接或間接抑制caspase通路而發(fā)揮抗凋亡的作用。王會(huì)等［11］的研究提出survivin的治療可以有效地殺死腫瘤細(xì)胞，并且最大限度地減少對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用，有望成為一種廣譜的腫瘤診斷標(biāo)記物，并可能是抗腫瘤治療的重要標(biāo)靶。林鳳如等［12］應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)檢測(cè)survivin在急性白血病骨髓細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果提示survivin表達(dá)陽性者明顯高于對(duì)照組，獲得完全緩解率明顯低于survivin陰性組，且預(yù)后較差。Mori等［13］在對(duì)survivin在白血病中表達(dá)的研究中發(fā)現(xiàn)，在31例AML及16例急性淋巴細(xì)胞白血病中，分別有17例及11例陽性表達(dá)survivin，其中M3型AML survivin表達(dá)水平最低;在慢性髓系白血病的慢性期沒有檢測(cè)到survivin的表達(dá)，而在7例急變期的病例中檢測(cè)到survivin的表達(dá);二甲亞砜、全反式維甲酸、腫瘤壞死因子可下調(diào)HL-60細(xì)胞的survivin表達(dá)水平，故認(rèn)為survivin與造血細(xì)胞的分化及白血病的發(fā)生有關(guān)。王曄［14］的研究表明survivin和bcl-2協(xié)同作用，促進(jìn)白血病的發(fā)生、發(fā)展。張嵐等［15］通過構(gòu)建含有人survivin基因的表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞的研究方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)急性白血病患者survivin mRNA的表達(dá)陽性率高于正常對(duì)照組，且其表達(dá)量在初發(fā)、復(fù)發(fā)及緩解時(shí)都較正常對(duì)照高。這些研究都提示survivin表達(dá)紊亂可能在急性白血病的發(fā)病過程中起重要作用，且有可能成為治療及預(yù)后的指標(biāo)之一。陳璽等［16］應(yīng)用蛋白印跡法檢測(cè)18例白血病患者化療前和10名正常對(duì)照組外周血中單個(gè)核細(xì)胞survivin蛋白的表達(dá)，并與患者的臨床特點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)survivin基因可選擇性地在白血病細(xì)胞中表達(dá)，提示survivin表達(dá)與白血病的發(fā)生有一定的關(guān)系。另外李文琦等［17］的研究也表明在成人(ALL)患者中，survivin的高表達(dá)可能造成預(yù)后不良。目前國內(nèi)外關(guān)于survivin的研究都是以治療前的白血病患者與健康人進(jìn)行對(duì)照，以此分析評(píng)價(jià)白血病患者在未經(jīng)治療的疾病狀態(tài)下其骨髓中survivin基因的表達(dá)情況。這樣的對(duì)照研究只能反映患者一個(gè)狀態(tài)時(shí)的狀況，而不能動(dòng)態(tài)綜合評(píng)價(jià)這一因素在白血病發(fā)生過程中的作用。本研究通過檢測(cè)在監(jiān)測(cè)期內(nèi)未轉(zhuǎn)化為惡性血液病的患者和AML患者骨髓細(xì)胞中survivin的表達(dá)，探討survivin在非惡性血液病以及AML骨髓細(xì)胞中表達(dá)的差異情況。同時(shí)將AML組分為治療未緩解組和治療緩解組，比較AML患者在經(jīng)治療未達(dá)緩解標(biāo)準(zhǔn)及經(jīng)治療達(dá)到完全或部分緩解標(biāo)準(zhǔn)時(shí)survivin的表達(dá)變化情況，以此對(duì)survivin在AML發(fā)生發(fā)展過程中的作用以及對(duì)臨床治療預(yù)后的影響綜合分析。另外本研究選用的流式細(xì)胞術(shù)較之目前普遍應(yīng)用的RTPCR法，不僅可以將骨髓細(xì)胞上survivin的表達(dá)定性，同時(shí)可以將這種表達(dá)定量分析，也使研究結(jié)果更具有說服力。

本研究顯示，加入了 survivin檢測(cè)抗體的AML患者的骨髓流式細(xì)胞分析圖中，survivin的表達(dá)并不只在異常增生的原始細(xì)胞中，所有骨髓細(xì)胞中都有survivin的表達(dá)，提示白血病發(fā)病時(shí)survivin表達(dá)的增多可能抑制了骨髓中所有細(xì)胞的正常凋亡，且這種異常表達(dá)可能不受白血病分型的影響。AML治療未緩解組骨髓中survivin的表達(dá)均明顯高于AML治療緩解組和非惡性血液病組，提示survivin在骨髓細(xì)胞中的表達(dá)對(duì)白血病治療效果及預(yù)后有可能有預(yù)估作用。survivin高表達(dá)的AML病例后期經(jīng)治療緩解率低或不能緩解，這與survivin的細(xì)胞選擇性表達(dá)的特性一致，表明survivin可能對(duì)白血病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有影響作用，也與張向峰等［18］的研究結(jié)果相類似。本研究中非惡性血液病組survivin的表達(dá)明顯低于AML治療未緩解組，而與AML治療緩解組無明顯差異。本研究推測(cè)survivin表達(dá)偏低時(shí)可能可以降低其他血液疾病轉(zhuǎn)化為白血病的風(fēng)險(xiǎn)，提示對(duì)survivin的檢測(cè)可以作為對(duì)非惡性血液病轉(zhuǎn)化為白血病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)估指標(biāo)。此外，本研究中共收取非惡性血液病患者34例，其中3例survivin表達(dá)較高，且實(shí)驗(yàn)期間轉(zhuǎn)化為骨髓增生異常綜合征(MDS)或白血病。本研究將survivin表達(dá)較低的31例非惡性血液病作為對(duì)照組，且在半年多研究期間暫未轉(zhuǎn)化為惡性血液病，是否提示survivin表達(dá)的升高有利于細(xì)胞逃離生長調(diào)控，促進(jìn)白血病細(xì)胞的過度增殖蓄積，從而引發(fā)白血病的發(fā)生還有待今后大樣本量的更加深入的研究。CD34是造血干/祖細(xì)胞的特征性標(biāo)志，近年國外文獻(xiàn)報(bào)道部分造血系統(tǒng)惡性腫瘤尤其是急性白血病存在早期分化抗原，如CD34、CD90和CD133的異常表達(dá)，作為干/祖細(xì)胞標(biāo)志又是重要黏附分子的CD34與急性白血病的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。因此CD34的檢測(cè)可以使白血病療效的觀察更具有針對(duì)性。本研究將CD34+在AML各表型間表達(dá)情況不盡相同的特點(diǎn)與survivin的表達(dá)對(duì)AML的影響作用相結(jié)合，把AML初發(fā)病例的治療未緩解組按表達(dá)情況進(jìn)一步分組加以分析。結(jié)果顯示被檢測(cè)的AML病例中所有提示有CD34+表達(dá)的病例均伴有survivin的表達(dá)，但所有提示有survivin表達(dá)的AML病例卻并不都伴有CD34+的表達(dá)。在CD34+不表達(dá)或表達(dá)較低的AML患者中，survivin基因高表達(dá)的患者同樣緩解率低或不能緩解。因此可以推斷當(dāng)骨髓細(xì)胞中開始出現(xiàn)異常增生的原始細(xì)胞時(shí)，survivin的過度表達(dá)可能比CD34有更顯著的病變提示價(jià)值。不久的將來通過更多更加深入的研究，survivin將可能成為臨床診斷和治療白血病的新的更為理想的標(biāo)志物和靶點(diǎn)。

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