邢 丹 趙彤言

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071)

騷擾庫蚊Culexpipipensmolestus，與淡色庫蚊Cx.pipienspallens、尖音庫蚊Cx.pipienspipiens和致倦庫蚊Cx.pipiensquinquefasciatus均屬于庫蚊屬genusCulex庫蚊亞屬subgenusCulex尖音庫蚊復(fù)合組。騷擾庫蚊是尖音庫蚊復(fù)合組的一個亞種，與該復(fù)合組其余成員不同的是，騷擾庫蚊是自育性蚊蟲，即完成第1次生殖周環(huán)不需要吸血。國內(nèi)學(xué)者對騷擾庫蚊分類學(xué)方面的研究較為詳細(xì)(趙彤言等，1993；1994；1996；1998)。在我國北京、上海、沈陽和赤峰地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)騷擾庫蚊。騷擾庫蚊與淡色庫蚊不存在地理隔離，屬同域分布，且兩者之間的成蟲和幼蟲在形態(tài)上極為相似，不易區(qū)分，雄蚊陽莖的形態(tài)特征是兩者鑒定的重要依據(jù)。在日常病媒生物監(jiān)測及控制工作中，在沒有正確分類的情況下，騷擾庫蚊通常被當(dāng)做淡色庫蚊來處理(趙彤言等，1993；王麗珠等，1993；海秀平等，2007；姬淑紅等，2010)。作者從內(nèi)蒙古滿洲里地區(qū)發(fā)現(xiàn)并采回自育性尖音庫蚊復(fù)合組蚊蟲，將其帶回實驗室進(jìn)行飼養(yǎng)傳代，并進(jìn)行自育性和雄蚊陽莖形態(tài)特征的研究，確認(rèn)其是是否是騷擾庫蚊。

昆蟲共生微生物Wolbachia是一類胞質(zhì)遺傳的立克次體，其廣泛存在于節(jié)肢動物體內(nèi)，可引起宿主的大量遺傳改變。Wolbachia改變和影響著其宿主的繁殖，包括誘導(dǎo)宿主間雜交的胞質(zhì)不融合，誘導(dǎo)單性生殖和雌性化。wsp基因是目前報道的Wolbachia基因中進(jìn)化最快的一個基因，由于特定基因區(qū)段的PCR特異性擴(kuò)增已經(jīng)成為鑒定昆蟲體內(nèi)共生菌的常規(guī)途徑，即可依據(jù)wsp基因?qū)olbachia進(jìn)行PCR檢測來說明昆蟲體內(nèi)感染W(wǎng)olbachia共生菌的情況。據(jù)報道我國尖音庫蚊復(fù)合組蚊蟲中Wolbachia感染現(xiàn)象十分普遍，北京地區(qū)騷擾庫蚊的雌蚊和雄蚊均感染W(wǎng)olbachia(宋社吾等，2000；2002；2002)。為了解野外采集到的騷擾庫蚊Wolbachia的侵染情況，以及它與不同地區(qū)的騷擾庫蚊感染情況是否相同，為將來在生物防治上利用Wolbachia提供依據(jù)，本文對其進(jìn)行了Wolbachia的PCR檢測。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源

本研究實驗用蟲來源于2009年7月上旬在內(nèi)蒙古滿洲里市扎賚諾爾區(qū)扎煤總醫(yī)院暖氣管地下井內(nèi)采集到的幼蟲，羽化后初步鑒定為尖音庫蚊復(fù)合組蚊蟲，飼養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)蚊蟲生殖為自育性，帶回本單位實驗室進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)和傳代。

1.2 自育性實驗

選擇羽化后雌、雄蚊各40只，置于30 cm×30 cm×40 cm的蚊籠內(nèi)，飼喂5%糖水，并放入收卵杯，每日觀察有無產(chǎn)卵，每日收集到的卵塊單獨(dú)飼養(yǎng)并記錄卵塊數(shù)、卵數(shù)和孵化幼蟲數(shù)，觀察其孵化率及自育率。

1.3 尾器標(biāo)本制作和測量

取出雄性成蚊標(biāo)本，在回軟器中，回軟24 h。用剪刀剪下腹部，至于小平皿中，加10%KOH溶液浸泡12 h，然后用蒸餾水沖洗3次。將沖洗后的腹部，用35%、55%、75%、95%酒精和無水乙醇，逐級脫水，每次30 min。在載玻片上滴小滴加拿大樹膠酚，將脫水后的腹部面朝上置于膠中在解剖鏡下解剖取出第八腹節(jié)以前的腹部，擺正位置。稍干后蓋上蓋玻片。在光學(xué)顯微鏡下觀察和測量D、V值，并計算DV/D值。

1.4 蚊蟲總DNA的制備

隨機(jī)挑選48只雌雄各半的野外采集到的騷擾庫蚊標(biāo)本，采用寶生物工程(大連)有限公司的DNA提取試劑盒，提取單只蚊蟲的基因組總DNA。

1.5 蚊蟲體內(nèi)Wolbachia的wsp基因片段的PCR擴(kuò)增

使用wsp基因通用引物從Wolbachia品系中擴(kuò)增出590～632 bp左右的目的片段(宋社吾等，2000)。通用引物為：81F 5′-TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC-3′和691R 5′-AAAAATTAAACGCTACTCCA-3′。擴(kuò)增體積為50 μL，包括PCR SuperMix(上海英俊生物有限公司)45 μL，正向、反向引物(20 μmol/L) 各1 μL，模板DNA為3 μL。PCR 擴(kuò)增程序為：94℃預(yù)變性3 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min， 72℃ 1 min， 擴(kuò)增35個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR 產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠(EB)染色，凝膠成像系統(tǒng)檢測并攝影。

2 結(jié)果

2.1 騷擾庫蚊雄蚊陽莖形態(tài)

內(nèi)蒙古滿洲里地區(qū)騷擾庫蚊雄蚊陽莖的特點與尖音庫蚊雄蚊陽莖的特點相同，即陽莖內(nèi)葉端角外伸，部分短而呈鉤狀，中葉末端平齊。而其與淡色庫蚊在形態(tài)上存在很大差異，后者陽莖內(nèi)葉端角外伸部分長而寬呈葉狀，中葉末端圓鈍。如圖1所示。

圖1 顯微鏡下騷擾庫蚊雄蚊陽莖(采集地：滿洲里)Fig.1 Male genitalia of Cx. pipipens molestus under microscope in manzhouli,Inner Mongolia

2.2 自育性實驗結(jié)果

內(nèi)蒙古滿洲里地區(qū)的騷擾庫蚊為自育性蚊蟲，40只雌蚊收集卵塊29塊，自育率為72.50%，其中總產(chǎn)卵蚊數(shù)為2 126枚，總孵化幼蟲數(shù)為1 888只，孵化率為88.76%，平均每雌產(chǎn)卵65.1枚(表1)。

表1 騷擾庫蚊卵孵化結(jié)果Tab.1 Hatching result of Cx. pipipens molestus eggs

2.3 騷擾庫蚊陽莖DV/D值

騷擾庫蚊雄蚊陽莖DV/D值如表2所示，由表中可以看出30個標(biāo)本中的DV/D值在-0.0648與0.0577之間。

表2 騷擾庫蚊雄蚊陽莖DV/D值Tab.2 The ratio of DV/D of male genitalia of Cx. pipipens molestus

圖2 騷擾庫蚊體內(nèi)Wolbachia的wsp基因的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Eletrophoresis of PCR products amplified using wsp specific primers on genomic DNA of Wolbachia harbored by Cx. pipipens molestus

2.4 騷擾庫蚊Wolbachia的PCR擴(kuò)增

運(yùn)用Wolbachia的wsp基因的通用引物81F和691R，成功從內(nèi)蒙古滿洲里地區(qū)的野外種群總DNA中擴(kuò)增出600 bp左右的目的片段。由圖2可見，48只騷擾庫蚊中感染W(wǎng)olbachia的有38只，感染率為79.17%。其中1～12與25～36為雄蚊，13～24與37～48為雌蚊；雌雄個體均有檢測到Wolbachia的目的條帶，感染率分別為70.83%和87.5%。將擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物送測序公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對確定為wsp基因序列。

3 討論

騷擾庫蚊一般是孳生于污水滲井等地方，也有文獻(xiàn)報道在明溝中發(fā)現(xiàn)其孳生(姬淑紅等，2010)。我國尖音庫蚊復(fù)合組雄性外生殖器的形態(tài)大致可以分為3個類型：尖音庫蚊型，其特點是陽莖內(nèi)葉端角外伸部分細(xì)短而呈鉤狀，中葉末端平齊；淡色庫蚊型，其特點是陽莖內(nèi)葉端角外伸部分長寬而呈葉狀，中葉末端圓鈍或平齊；致倦庫蚊型，其特點是陽莖內(nèi)葉外伸部分也呈寬葉狀，而中葉末端削尖(陳漢彬，1988)。在這些類型進(jìn)一步鑒別中，常利用雄蚊陽莖DV/D的數(shù)值進(jìn)行判斷，認(rèn)為DV/D<0.2為尖音庫蚊，0.20.5為致倦庫蚊(趙彤言等，1994)。騷擾庫蚊雄蚊陽莖的形態(tài)特征與尖音庫蚊相同，與淡色庫蚊存在較大差別，而且其雌蚊為自育性蚊蟲，即不需要吸血便可完成第一次產(chǎn)卵。在北方地區(qū)騷擾庫蚊與淡色庫蚊是城鎮(zhèn)入室吸血的主要蚊蟲。通過對內(nèi)蒙古滿洲里地區(qū)采集到的蚊蟲的雄蚊陽莖形態(tài)與蚊蟲生存環(huán)境及自育性綜合分析，且DV/D<0.2與尖音庫蚊相似，平均每雌產(chǎn)卵65.1枚，與文獻(xiàn)報道相似(趙彤言等，1993；余靜等，2009)。說明該地區(qū)采集到的尖音庫蚊復(fù)合組蚊蟲完全符合騷擾庫蚊的各項條件，進(jìn)一步證明在內(nèi)蒙古滿洲里地區(qū)采集到的尖音庫蚊復(fù)合組蚊蟲是騷擾庫蚊，確定內(nèi)蒙古發(fā)現(xiàn)騷擾庫蚊新記錄。

各種節(jié)肢動物體內(nèi)Wolbachia的感染情況呈現(xiàn)多樣性，據(jù)報道Kondo等(2002)檢測的綠豆象Callosobruchuschinensis感染率為100%；Turelli等(1995)檢測的擬果蠅Drosophilasimulans感染率為94%；赤眼蜂科Trichogrammakaykai的感染率為20%(Stouthameretal.，1994)，而赤眼蜂科T.deion感染率僅有0.88%(Huigens，2003)。關(guān)于昆蟲感染W(wǎng)olbachia的研究較多，據(jù)文獻(xiàn)報道不同地區(qū)昆蟲種類中的Wolbachia感染率在16.7%與57.1%之間，其中蝴蝶種類的感染率最低為16.7%，而朱砂葉螨感染率最高為57.1%(苗慧等，2004)。而就騷擾庫蚊而言，在我國只對尖音庫蚊復(fù)合組的4個亞種實驗室種群及采集于我國華北、華東和華南的尖音庫蚊復(fù)合組不同地理株蚊蟲中Wolbachia的侵染做過研究，但并未對該復(fù)合組4亞種蚊蟲的感染率進(jìn)行測定(宋社吾等，2000)。本文通過隨機(jī)選取48只內(nèi)蒙古滿洲里采集到騷擾庫蚊進(jìn)行Wolbachia的PCR擴(kuò)增，與苗慧等文中的不同昆蟲的感染率相比，其感染率明顯高于其他昆蟲，說明較其他昆蟲來講騷擾庫蚊中的Wolbachia侵染十分嚴(yán)重，同時也說明Wolbachia廣泛存在于騷擾庫蚊雌蚊和雄蚊中。騷擾庫蚊野外采集到的雌雄個體均能感染W(wǎng)olbachia，但其感染情況存在差別，這可能跟其所處環(huán)境、自育性、誘導(dǎo)生殖不親和、胞質(zhì)不融合、誘導(dǎo)孤雌生殖、雄性致死、雌性化和調(diào)節(jié)繁殖力等相關(guān)。