許亞坡，周 琳，王春峰，張連峰

鄭州大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450052

原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是臨床常見的富血管惡性腫瘤，生長快，易轉(zhuǎn)移和浸潤，總體預后較差，5 a生存率僅為3%～5%[1]。我國乙型肝炎病毒攜帶者約占全球的1/3[2],肝癌發(fā)病人數(shù)占到了全球的55%[3]，嚴重影響著人們的健康。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅱ(angiotensin converting enzyme Ⅱ，ACE2)是目前發(fā)現(xiàn)的惟一的ACE同工酶[4]，但有關(guān)ACE2與HCC可能的關(guān)系及其臨床意義方面國內(nèi)外均無相關(guān)報道。該研究采用免疫組化法對HCC、癌旁肝硬化及正常組織的ACE2和血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R)蛋白表達進行檢測，旨在探討兩者在HCC組織中的表達情況、相互關(guān)系及在HCC發(fā)病中的意義，有望為HCC的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1標本及試劑選取鄭州大學第一附屬醫(yī)院2011年6月至2012年6月經(jīng)外科手術(shù)切除的HCC組織標本82例及非同一批HCC患者遠離癌灶無浸潤的肝硬化組織標本40例(男24例，女16例，年齡31～69歲，中位年齡50歲)，取同期肝血管瘤旁的正常肝組織標本24例(男14例，女10例，年齡28～68歲，中位年齡48歲)作對照，以上均為存檔蠟塊，并經(jīng)病理醫(yī)師證實。HCC患者中男57例，女25例；年齡33～75歲，中位年齡54歲，其中<50歲者28例，≥50歲者54例；術(shù)前均未接受放化療及免疫治療；其中高分化癌24例，中分化癌32例，低分化癌26例；腫瘤直徑<5 cm者36例，≥5 cm者46例；有門脈浸潤者37例，無浸潤者45例；TNM臨床分期，Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期49例。ACE2及AT1R兔抗人多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司，SP檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2ACE2及AT1R蛋白的免疫組化檢測操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行，標本均經(jīng)體積分數(shù)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。脫蠟水化，檸檬酸緩沖液抗原高溫、高壓修復，體積分數(shù)3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉非特異性抗原，滴加抗AT1R或ACE2一抗(均為1200稀釋)，4 ℃過夜，滴加生物素標記的二抗，孵育后DAB顯色，蘇木素復染，經(jīng)脫水、透明、封片后顯微鏡下觀察。實驗中以已知的陽性組織作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3結(jié)果判斷AT1R及ACE2均著色在細胞的胞質(zhì)和胞膜上，AT1R陽性染色表現(xiàn)為淺黃色、棕黃色或棕褐色，ACE2為淺黃色、棕黃色或深棕色。所有切片均在高倍鏡(×400)下觀察10個視野，根據(jù)陽性細胞著色程度及陽性細胞百分比進行評分。著色程度評分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色或棕褐色為3分。陽性細胞百分比評分：無陽性細胞為0分，陽性細胞百分比<25%為1分，25%～為2分，50%～為3分，75%～為4分。結(jié)果取2項評分之和，<10分為陰性，≥10分為陽性[5]。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，對3種組織中AT1R及ACE2蛋白陽性率的比較采用χ2檢驗，對二者與HCC組織不同病理特征之間的關(guān)系采用χ2檢驗進行分析，HCC組織中二者的相關(guān)性分析采用列聯(lián)系數(shù)，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1AT1R及ACE2蛋白在3種組織中的表達結(jié)果見圖1和表1。

圖1 AT1R(1)和ACE2(2)蛋白在HCC(A)、肝硬化(B)和正常肝(C)組織中的表達情況(SP,×400)

表1 AT1R及ACE2蛋白在HCC、肝硬化和正常肝組織中的表達情況 例(%)

*:3組間兩兩比較，P均<0.016；#：與正常肝組織比較，P均<0.016。

2.2AT1R及ACE2蛋白表達與HCC臨床病理特征之間的關(guān)系兩者在HCC組織中的表達均與腫瘤的分化程度、臨床分期及門脈浸潤有關(guān)，而與患者性別、年齡及腫瘤大小無關(guān)，見表2。

表2 HCC組織中AT1R及ACE2的表達與臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

*:校正χ2檢驗。

2.3HCC組織中AT1R及ACE2蛋白表達的相關(guān)性分析兩者在HCC組織中的表達有關(guān)，見表3。

表3 HCC組織中AT1R及ACE2蛋白表達的關(guān)系 例

rP=0.543，P<0.001。

3 討論

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)是人體內(nèi)重要的內(nèi)分泌系統(tǒng)，目前對其認識多集中在對心血管系統(tǒng)的作用上，參與高血壓、動脈粥樣硬化、心力衰竭等疾病的發(fā)生發(fā)展[6]。肝臟組織出現(xiàn)炎癥、壞死時，RAS系統(tǒng)變得活躍，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)及AT1R增多，通過激活肝星狀細胞促進肝纖維化及肝硬化的形成?；钴S的RAS系統(tǒng)可通過誘導血管內(nèi)皮生長因子等活性成分的增加促使腫瘤血管的形成[7]，從而為腫瘤細胞提供營養(yǎng)，這可能是HCC組織中AT1R蛋白高表達的重要原因。有研究[8]已經(jīng)證實RAS系統(tǒng)的拮抗劑可通過抑制AngⅡ起到抗纖維化的作用。

ACE2是目前發(fā)現(xiàn)的惟一的ACE同工酶。ACE2最重要的作用是使AngⅡ失活，將之水解生成活性七肽Ang-(1-7)，并作用于特異性的Mas受體，進而發(fā)揮其拮抗AngⅡ的作用，產(chǎn)生抗炎、抗纖維化等效應[9]。ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸被認為是ACE-AngⅡ-AT1R的反向調(diào)節(jié)軸[10]。有研究[11]表明ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸對肝臟具有保護作用。該研究結(jié)果顯示HCC組織中ACE2的表達明顯高于正常組織，說明在AT1R作用軸與肝臟病變相互促進的同時，ACE2作用軸也被激發(fā)，并可能發(fā)揮反向調(diào)節(jié)而遏制病變的效應。其保護肝臟的機制可能與ACE2可以消除AngⅡ的縮血管作用，增加局部供氧、抗纖維化有關(guān)[12-13]。與AT1R一樣，ACE2也與腫瘤的發(fā)病密切相關(guān)。對胰腺癌的研究[14]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ACE2具有抑制胰腺癌發(fā)生發(fā)展的作用。該研究發(fā)現(xiàn)HCC組織中ACE2蛋白的表達相比正常組織升高，說明ACE2作用軸同樣也貫穿在HCC的發(fā)生發(fā)展中。

RAS系統(tǒng)的活性還與臨床上肝病的臨床特征、病理分級等密切相關(guān)。該研究發(fā)現(xiàn)HCC組織中ACE2與AT1R的表達有關(guān)，且均與腫瘤分化程度、臨床分期及門脈浸潤密切相關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)。這也說明ACE2及AT1R兩者參與HCC發(fā)生發(fā)展的全過程，能反映其嚴重程度，有助于早期診斷和預后判斷。

綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)ACE2及AT1R在HCC組織中表達均較正常組織升高，并且其表達與分化程度、臨床分期等有密切關(guān)系，這預示著二者在HCC發(fā)病的過程中起著重要作用。進一步對其作用機制的研究有望為HCC的診斷與預后判斷，尤其是為治療開辟新的途徑。

[1]陳丹丹,劉媛,姬旭慧,等. 原發(fā)性肝癌發(fā)病影響因素的病例對照研究[J]. 鄭州大學學報：醫(yī)學版,2013,48(2):249

[2]戴啟宇,宋蓓,呂書鋒. 慢性乙型肝炎的臨床及實驗室檢查研究進展[J]. 實用兒科臨床雜志，2009,24(10):792

[3]賈紅軍,張麗娜,文翠容,等. 290例肝癌患者死因分析[J]. 解放軍醫(yī)學雜志，2010,35(12):1511

[4]Yoshiji H,Noquchi R,Ikenaka Y,et al. Impact of renin-angiotensin system in hepatocellular carcinoma[J]. Curr Cancer Drug Targets，2011,11(4):431

[5]韓宏光,邢雪,張建. 血管緊張素Ⅱ及其受體在人肝癌中的表達及其臨床意義[J]. 中國普通外科雜志,2009,18(2):190

[6]Won SM,Park YH,Kim HJ,et al.Catechins inhibit angiotensin Ⅱ-induced vascular smooth muscle cell proliferation via mitogen-activated protein kinase pathway[J]. Exp Mol Med，2006,38(5):525

[7]Egami K,Murohara T,Shimada T,et al. Role of host angiotensin Ⅱ type 1 receptor in tumor angiogenesis and growth[J]. J Clin Invest,2003,112(1):67

[8]徐貴平,萇新明,和水祥.等. 大劑量螺內(nèi)酯對大鼠肝纖維化進展及血管緊張素Ⅱ水平的影響[J]. 西安交通大學學報：醫(yī)學版，2004,25(2):151

[9]Pereira RM，dos Santos RA,da Costa Dias FL,et al. Renin-angiotensin system in the pathogenesis of liver fibrosis[J]. World J Gastroenterol,2009,15(21):2579

[10]Iwai M,Horiuchi M. Devil and angel in the renin-angiotensin system: ACE-angiotensin Ⅱ-AT1 receptor axisvs. ACE2-angiotensin-(1-7)-Mas receptor axis[J]. Hypertens Res，2009,32(7):533

[11]Santos RA,Ferreira AJ,Sim?es E Silva AC. Recent advances in the angiotensin-converting enzyme 2-angiotensin(1-7)-Mas axis[J]. Exp Physiol,2008,93(5):519

[12]Ferrario CM,Trask AJ,Jessup JA. Advances in biochemical and functional roles of angiotensin-converting enzyme 2 and angiotensin (1-7) in regulation of cardiovascular function[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2005,289(6):H2281

[13]李晶,曹鴻雁,秦玲. 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2與原發(fā)性高血壓及心功能的關(guān)系[J]. 吉林大學學報：醫(yī)學版,2011,37(5):909

[14]Zhou L,Zhang R,Zhang L,et al. Angiotensin-converting enzyme 2 acts as a potential molecular target for pancreatic cancer therapy[J]. Cancer Lett,2011,307(1):18