馮霞 劉子杰 何成祿 徐從瓊 李婭 何增品 謝瓊

Phadia250全自動(dòng)體外檢測(cè)系統(tǒng)是由瑞典Phadia公司研制，基于熒光酶聯(lián)免疫分析法原理，以提供過(guò)敏、氣喘及自體免疫疾病的臨床診斷和監(jiān)控為目的，集反應(yīng)、檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析為一體的全自動(dòng)熒光免疫分析系統(tǒng)。ImmunoCAP特異性IgE定量是檢測(cè)人血清或血漿中過(guò)敏原特異性IgE的體外實(shí)驗(yàn)方法，是用羊抗人IgE抗體包被的ImmunoCAP，捕獲血清中存在的人體受食物和空氣中變應(yīng)原攻擊后所產(chǎn)生的特異性IgE抗體，再以熒光標(biāo)記的發(fā)展液與之結(jié)合，熒光強(qiáng)度的大小與待檢特異性IgE的含量呈正相關(guān)。以WHO標(biāo)定的IgE標(biāo)準(zhǔn)品含量的對(duì)數(shù)做橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制半對(duì)數(shù)曲線，由該曲線可以確定不同的熒光強(qiáng)度所對(duì)應(yīng)的特異性IgE含量。PhadiaImmunoCAP檢測(cè)過(guò)敏原的方法被認(rèn)為是國(guó)際過(guò)敏原檢測(cè)的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)，其他任何一種方法都要與其進(jìn)行比較。我科于2011年購(gòu)買(mǎi)了一臺(tái)該型號(hào)的儀器，我們對(duì)該儀器的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、重復(fù)性、線性等相關(guān)性能的進(jìn)行了評(píng)價(jià)，現(xiàn)將檢測(cè)結(jié)果報(bào)告如下。

1 儀器與方法

1.1 儀器 瑞典Phadia AB公司生產(chǎn)的Phadia 250全自動(dòng)體外熒光免疫分析系統(tǒng)。

1.2 試劑ImmunoCAP特異性IgE質(zhì)控品、ImmunoCAP特異性IgE校準(zhǔn)品(條)0-100、ImmunoCAP特異性IgE酶標(biāo)二抗、清洗液、底物液以及終止液等。所用試劑及質(zhì)控品均為Phadia AB公司原裝進(jìn)口。

1.3 加樣精度 分別對(duì)樣本(sample)、發(fā)展液(development)和終止液(stop solution)加樣量進(jìn)行測(cè)試，按IDM軟件中虛擬Immuno反應(yīng)盤(pán)提示，將20個(gè)已稱(chēng)重量(G1)的檢測(cè)Immuno-CAP放入反應(yīng)盤(pán)中的正確位置，選擇“Replicate”為20次。執(zhí)行加樣操作后，將檢測(cè)CAP小心取出，并立刻稱(chēng)重(G2)。加樣重量(G)按G=G2-G1。計(jì)算20次加樣的均值和CV%，CV%應(yīng)小于廠家聲明的加樣2%。

1.4 精密度 該方案在EP-5文件的關(guān)于精密度方案的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，取足夠量的特異性IgE項(xiàng)目?jī)蓚€(gè)濃度(低值0.35 kUA/L、高值100kUA/L)的陽(yáng)性質(zhì)控品，每天做2批實(shí)驗(yàn)，批間的時(shí)間相差不少于2 h，每批的樣品做雙份檢測(cè)，共做5 d實(shí)驗(yàn)。一共20個(gè)結(jié)果，每對(duì)結(jié)果間的差是每批的批內(nèi)差。一天中每批雙份結(jié)果的均值之間的差表示這一天的批間差。對(duì)這些批間差統(tǒng)計(jì)后，減去其中的批內(nèi)差，成為真正的批間不精密度[1]。并按公式(1)計(jì)算變異系數(shù)(CV，%)，變異系數(shù)應(yīng)符合廠商聲明的要求，批內(nèi)精密度(CV，%)≤5%，批間批間精密度(CV，%)≤5%。

1.5 準(zhǔn)確性 ①陽(yáng)性質(zhì)控品:測(cè)試特異性IgE項(xiàng)目三個(gè)濃度的陽(yáng)性質(zhì)控品(0.35 kUA/L、17.5 kUA/L、100 kUA/L)，每個(gè)質(zhì)控品測(cè)試2次，分別計(jì)算平均值，平均值應(yīng)在標(biāo)稱(chēng)范圍內(nèi)。并分別計(jì)算絕對(duì)偏差=測(cè)定值-靶值，相對(duì)偏差=絕對(duì)偏差/靶值×100%，因國(guó)際及廠家均無(wú)此項(xiàng)有關(guān)偏倚的聲明，參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室修正法規(guī)(CLIA'88)規(guī)定的總允許誤差[2]。允許偏倚設(shè)為15%。②陰性質(zhì)控品:測(cè)試樣本稀釋液和0.35 kUA/L陽(yáng)性質(zhì)控品各2次，分別計(jì)算熒光響應(yīng)值平均值，稀釋液熒光響應(yīng)平均值應(yīng)＜0.35 kUA/L陽(yáng)性質(zhì)控品熒光響應(yīng)值。

1.6 線性 將特異性IgE濃度為90kUA/L的標(biāo)本(H)，混合均勻后，用專(zhuān)用 Diluent稀釋液(L)按 H、1 h+5 L、2 h+4 L、3 h+3 L、4 h+2 L、5 h+1 L、L進(jìn)行稀釋?zhuān)礉舛扔筛叩降偷捻樞蜻M(jìn)行檢測(cè)后，在按濃度由低到高的順序進(jìn)行檢測(cè)。取各濃度水平的平均值。以稀釋濃度(預(yù)期值)為自變量，以測(cè)定結(jié)果均值(實(shí)測(cè)值)為因變量求出線性回歸方程，計(jì)算線性回歸的相關(guān)系數(shù)。

1.7 攜帶污染率 取高濃度特異性IgE質(zhì)控品(100kUA/L)和低濃度質(zhì)控品(0.35kUA/L)各一份，先測(cè)定高值3次(H 1、H2、H 3)，再測(cè)定3 次低次(L1、L2、L3); 同樣先測(cè)定高值3 次(H 1、H2、H3)，再測(cè)定3 次低值(L1、L2、L3)。按公式:K=[(L1-L3)/(H 3-L3)]計(jì)算攜帶污染率。按廠家聲明，攜帶污染率應(yīng)＜10-4。

1.8 報(bào)告范圍 按照CLSI EP9-A2文件，隨機(jī)選取無(wú)過(guò)敏史及風(fēng)濕免疫性疾病史的健康體檢志愿者20例(男、女各10例)作為參考個(gè)體，比較小樣本參考區(qū)間和廠家提供參考區(qū)間之間的可比性。如果20例參考個(gè)體中不超過(guò)2例(或10%的結(jié)果)的觀察值在廠家提供的參考區(qū)間之外，廠家提供的95%參考區(qū)間可以接受，也就是說(shuō)，可以直接引用廠家提供的參考區(qū)間[3]。

2 結(jié)果

2.1 加樣精密度 進(jìn)入儀器“PIPETTE DISPENSING TEST”界面，分別選擇樣本(sample)、發(fā)展液(development)和終止液(stop solution)測(cè)試，按IDM軟件中虛擬Immuno反應(yīng)盤(pán)提示，將20個(gè)已稱(chēng)重量(G1)的檢測(cè)ImmunoCAP放入反應(yīng)盤(pán)中的正確位置，選擇“Replicate”為20次。執(zhí)行加樣操作后，將檢測(cè)CAP小心取出，并立刻稱(chēng)重(G2)。加樣重量(G)按G=G2-G1。計(jì)算20次加樣的均值和CV%。

樣本(sample)、發(fā)展液(development)和終止液(stop solution)三種加樣量的加樣精度驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表1。均小于廠家聲明的加樣CV% ＜2%。

表1 加樣精度

2.2 精密度 按預(yù)定方案進(jìn)行精密度驗(yàn)證，低值和高值定值質(zhì)控精密度見(jiàn)表2和表3。

表1 低值(0.35kUA/L)精密度

表2 高值(100kUA/L)精密度

2.3 準(zhǔn)確度 陽(yáng)性定值質(zhì)控準(zhǔn)確度結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 陽(yáng)性定值質(zhì)控驗(yàn)證結(jié)果

2.4 線性 將特異性IgE濃度為100的患者血清用專(zhuān)用“dilution”稀釋后，按預(yù)定方案測(cè)定2次，各點(diǎn)平均濃度分別為0.35、8.99、36.6、57.3、71.3、85.3 和 92.5 kUA/L，其測(cè)定值與理論值的直線相關(guān)系數(shù)為0.987，R2=0.974，特異性IgE預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值散點(diǎn)圖見(jiàn)下圖。

2.5 攜帶污染率 高值和低值各次的平均值為:96.5 kUA/L、97.4 kUA/L、100 kUA/L、0.35 kUA/L、0.35 kUA/L、0.36 kUA/L。根據(jù)公式K=(L1-L3)/(H3-L3)計(jì)算攜帶污染率。特異性IgE的攜帶污染率為0.1×10-4。符合廠家聲明相符。

2.6 報(bào)告范圍 隨機(jī)選取無(wú)過(guò)敏史及風(fēng)濕免疫性疾病史的健康體檢志愿者20名，采空腹血5 ml，測(cè)定血清中特異性IgE水平，0.35 kUA/L質(zhì)控品的平均熒光響應(yīng)值143。健康志愿者該項(xiàng)目熒光響應(yīng)值除1例為174，其余均低于143，最小響應(yīng)值為21。廠家提供的特異性IgE參考范圍為＜0.35 kUA/L，20名志愿者中，有19例測(cè)定值在該范圍之內(nèi)。

3 結(jié)論

根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(clin ica l and laboratory standards institute，CLSI)在 EP19-P中的注釋?zhuān)?yàn)證(demonstrat ion)是由醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部門(mén)進(jìn)行，驗(yàn)證所使用系統(tǒng)獲得預(yù)期性能方面的能力，并且驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方案要求簡(jiǎn)便、實(shí)用、易于操作[4]。本實(shí)驗(yàn)除進(jìn)行了精密度、準(zhǔn)確度、線性范圍及參考區(qū)間的驗(yàn)證外，還對(duì)儀器的加樣精度、攜帶污染進(jìn)行了驗(yàn)證，并以制造商儀器說(shuō)明書(shū)和試劑說(shuō)明書(shū)中聲明的性能指標(biāo)為驗(yàn)證目標(biāo)或標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判斷驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的成功與否。

Phadia 250全自動(dòng)熒光免疫系統(tǒng)由于其基于ImmunoCAP的特殊固相免疫反應(yīng)設(shè)計(jì)。其加樣精度的驗(yàn)證不同于其他免疫系統(tǒng)或全自動(dòng)生化分析系統(tǒng)，必須依賴于檢測(cè)ImmunoCAP進(jìn)行稱(chēng)重。儀器右側(cè)的加樣針只進(jìn)行40ul的樣本或酶液的吸取，左邊的加樣針僅進(jìn)行50ul的development和200ul的stop solution的吸取。并對(duì)相應(yīng)體積進(jìn)行了固定。本實(shí)驗(yàn)中，各種液體的加樣量均符合相應(yīng)要求。

Phadia250全自動(dòng)體外檢測(cè)系統(tǒng)是瑞典生產(chǎn)并提供試劑的全封閉性系統(tǒng)，提供了歐美人群的特異性IgE參考區(qū)間，所以只需要選擇20個(gè)參考個(gè)體的樣本進(jìn)行驗(yàn)證，20例樣本特異性IgE的熒光響應(yīng)值僅有1例超出參考范圍下限0.35的熒光響應(yīng)值，其余均在此范圍內(nèi)，可以引用此參考區(qū)間作為本實(shí)驗(yàn)室特異性IgE的參考區(qū)間。

綜上所述，Phadia250全自動(dòng)體外檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定特異性IgE的精密度、準(zhǔn)確度、分析測(cè)量范圍及參考范圍性能均與廠家聲明一致;此驗(yàn)證方案和實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)便可行，可用于其他項(xiàng)目的性能驗(yàn)證。

[1]馮仁峰.臨床檢驗(yàn)質(zhì)量管理技術(shù)基礎(chǔ).第1版.上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2003:42.

[2]張秀明，溫冬梅，袁勇.臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)質(zhì)量管理與標(biāo)準(zhǔn)操作程序.北京:人民軍醫(yī)出版社，2007:103.

[3]王凡，蔣紅君.羅氏2010免疫分析儀檢測(cè)甲胎蛋白的性能驗(yàn)證. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)，2012，39(15):3911-3914.

[4]張莉，吳炯，郭瑋，等.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)用前的性能評(píng)價(jià).檢驗(yàn)醫(yī)，2006，21(6):560-563.