司曉燕 高言寶

腫瘤免疫治療是目前研究的熱點(diǎn)之一，但由于腫瘤的低免疫原性和機(jī)體對(duì)腫瘤的低免疫反應(yīng)性，使得免疫治療受到限制。細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)的殺傷活性在機(jī)體抗腫瘤效應(yīng)中起關(guān)鍵作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境處于免疫抑制狀態(tài)，樹突狀細(xì)胞(DC)不能有效地遞呈抗原[2]，因而不能誘導(dǎo)CTL殺傷腫瘤細(xì)胞。細(xì)菌及其制劑是最早采用的非特異性免疫刺激劑，研究發(fā)現(xiàn)它們能激發(fā)和增強(qiáng)機(jī)體的特異與非特異免疫機(jī)能，達(dá)到抗腫瘤作用。血型抗原亦可引起很強(qiáng)的抗血型免疫反應(yīng)，可能激發(fā)和增強(qiáng)機(jī)體的特異與非特異免疫機(jī)能。本研究是利用兩種異種抗原(滅活鏈球菌和A型血型抗原)瘤內(nèi)注射并配合全身免疫來治療腫瘤，將抗細(xì)菌、抗血型免疫反應(yīng)和二次免疫應(yīng)答引入腫瘤局部，希望能夠改善腫瘤局部的免疫抑制微環(huán)境，打破免疫耐受，使DC遞呈腫瘤抗原，誘導(dǎo)CTL殺傷腫瘤細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液、PBS、小鼠紅細(xì)胞裂解液及MTT試劑盒均購(gòu)自普利萊基因技術(shù)有限公司。滅活鏈球菌粉劑(α-溶血性鏈球菌經(jīng)60Co機(jī)照射24 h滅活)及人A型血型抗原由南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院腫瘤中心實(shí)驗(yàn)室提取。利用血型抗原免疫及瘤內(nèi)注射來治療腫瘤的實(shí)驗(yàn)方法已申請(qǐng)專利，專利號(hào)為200810029547.9。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及腫瘤細(xì)胞株 試驗(yàn)用動(dòng)物為4～6周齡昆明種小鼠，體重18～20 g，雌雄兼用，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。小鼠肉瘤S180細(xì)胞株由南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組:昆明小鼠42只，每組6只，隨機(jī)分為7組:①滅活鏈球菌全身免疫及瘤內(nèi)注射組。②滅活鏈球菌僅全身免疫組。③滅活鏈球菌僅瘤內(nèi)注射組;①A型血型抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組。②A型血型抗原僅全身免疫組。③A型血型抗原僅瘤內(nèi)注射組。④空白對(duì)照組。

1.2.2 小鼠實(shí)體瘤制作方法 先制作S180腹水型小鼠，再?gòu)男∈蟾骨粺o(wú)菌抽取癌腹水，制成癌細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml，取0.1 ml用于小鼠背部皮下接種以制作實(shí)體瘤模型，成瘤率近100%[3]。

1.2.3 造模過程 前兩周用異種抗原全身免疫小鼠4次，2次/周(A、B組小鼠腹腔注射濃度為0.1 g/ml的滅活鏈球菌0.1 ml/只;a、b組小鼠腹腔注射濃度為5 mg/ml的A型血型抗原0.1 ml/只;同時(shí)C、c、D(d)組小鼠均腹腔注射生理鹽水0.1 ml/只)。然后于7組小鼠背部皮下接種濃度為1×107個(gè)/ml的S180細(xì)胞0.1 ml/只，約兩周長(zhǎng)成大小為1 cm3左右的腫塊，隨后連續(xù)5 d瘤內(nèi)注射異種抗原(A、C組小鼠瘤內(nèi)注射濃度為0.1 g/ml的滅活鏈球菌0.1 ml/只/;a、c組小鼠瘤內(nèi)注射濃度為5 mg/ml的A型血型抗原0.1 ml/只;同時(shí)B、b、D(d)組小鼠均瘤內(nèi)注射生理鹽水0.1 ml/只)。瘤內(nèi)注射結(jié)束3 d后，處死小鼠。

1.2.4 小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液的制備 參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行，為殺傷試驗(yàn)提供效應(yīng)細(xì)胞。

1.2.5 靶細(xì)胞懸液的制備 常規(guī)培養(yǎng)小鼠肉瘤S180細(xì)胞，為殺傷實(shí)驗(yàn)提供靶細(xì)胞。

1.2.6 體外殺傷活性測(cè)定 用MTT比色法測(cè)定不同處理組小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)S180細(xì)胞的體外殺傷活性[5]。調(diào)整脾淋巴細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml，S180細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，效應(yīng)細(xì)胞:靶細(xì)胞(E∶T)=20∶1。取效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞各100ul加入到96孔板，5%CO2，37℃培養(yǎng)24 h后，加入5 mg/ml的 MTT 10ul，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，1000r/min 離心 5 min，棄上清加150ul二甲基亞砜震蕩，待藍(lán)紫色沉淀溶解后，用酶聯(lián)儀于波長(zhǎng)570nm處測(cè)定，讀取A值，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照、靶細(xì)胞對(duì)照(T)、效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照(E)，每組均設(shè)三個(gè)復(fù)孔，取其均值，按下式計(jì)算殺傷活性:

2 結(jié)果

2.1 滅活鏈球菌實(shí)驗(yàn)4組小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)S180細(xì)胞的殺傷率見表1。經(jīng)總體方差分析處理組間差異有顯著性(F=366.675，P=0.000)。經(jīng)多重比較，滅活鏈球菌全身免疫及瘤內(nèi)注射組脾淋巴細(xì)胞對(duì)S180細(xì)胞的殺傷活性顯著高于滅活鏈球菌僅全身免疫組、滅活鏈球菌僅瘤內(nèi)注射組和空白對(duì)照組(P=0.000，P=0.000和P=0.000);同時(shí)滅活鏈球菌僅瘤內(nèi)注射組也高于滅活鏈球菌僅全身免疫組和空白對(duì)照組(P=0.000和P=0.000);而滅活鏈球菌僅全身免疫組和空白對(duì)照組卻無(wú)顯著性差異(P=1.000)。

表1 4組小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)S180細(xì)胞的殺傷活性(A值，±s)

表1 4組小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)S180細(xì)胞的殺傷活性(A值，±s)

小組 樣本數(shù) 殺傷率(A)滅活鏈球菌全身免疫及瘤內(nèi)注射組6 9.85%±2.76%6 63.17%±3.94%(B)滅活鏈球菌僅全身免疫組 6 10.26% ±1.95%(C)滅活鏈球菌僅瘤內(nèi)注射組 6 33.30% ±3.82%(D)空白對(duì)照組

2.2 A型血型抗原實(shí)驗(yàn)4組小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)S180細(xì)胞的殺傷率見表2。經(jīng)總體方差分析處理組間差異有顯著性(F=437.790，P=0.000)。經(jīng)多重比較，A型血型抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組脾淋巴細(xì)胞對(duì)S180細(xì)胞的殺傷活性顯著高于A型血型抗原僅全身免疫組、A型血型抗原僅瘤內(nèi)注射組和空白對(duì)照組(P=0.000，P=0.000和P=0.000);同時(shí)A型血型抗原僅瘤內(nèi)注射組也高于A型血型抗原僅全身免疫組和空白對(duì)照組(P=0.000和P=0.000);而A型血型抗原僅全身免疫組和空白對(duì)照組卻無(wú)顯著性差異(P=1.000)。

表2 4組小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)S180細(xì)胞的殺傷活性(A值，±s)

表2 4組小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)S180細(xì)胞的殺傷活性(A值，±s)

6 9.85%±2.76%6 76.27%±4.07%(b)A型血型抗原僅全身免疫組 6 10.55% ±2.29%(c)A型血型抗原僅瘤內(nèi)注射組 6 40.92%±4.98%(d)空白對(duì)照組小組 樣本數(shù) 殺傷率(a)A型血型抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組

2.3 兩種異種抗原免疫及瘤內(nèi)注射激活的小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)S180細(xì)胞的殺傷活性比較:經(jīng)兩樣本t檢驗(yàn)，A型血型抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組的殺傷活性高于滅活鏈球菌全身免疫及瘤內(nèi)注射組(t=5.662，P=0.000);A型血型抗原僅瘤內(nèi)注射組的殺傷活性也高于滅活鏈球菌僅瘤內(nèi)注射組(t=2.973，P=0.014)。

3 討論

目前腫瘤免疫治療研究的熱點(diǎn)主要集中在抗癌效應(yīng)細(xì)胞、細(xì)胞因子、抗癌抗體、瘤苗及基因治療的各個(gè)方面。腫瘤抗原與免疫耐受是腫瘤免疫的兩個(gè)最重要的主題，如何增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞免疫原性及打破腫瘤免疫耐受狀態(tài)，是設(shè)計(jì)腫瘤免疫治療方案時(shí)首先要考慮的問題?？鼓[瘤免疫效應(yīng)一般以細(xì)胞免疫為主，尤其是細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)的殺傷活性在機(jī)體抗腫瘤效應(yīng)中起關(guān)鍵作用[6]。腫瘤抗原的識(shí)別、加工、提呈及T淋巴細(xì)胞的致敏、激活依賴于抗原提呈細(xì)胞(APC)。樹突狀細(xì)胞(DC)是目前已知體內(nèi)抗原呈遞功能最強(qiáng)的APC[7]。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤局部微環(huán)境處于免疫抑制狀態(tài)，其內(nèi)的細(xì)胞免疫亦存在著一個(gè)復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[8]。在腫瘤患者體內(nèi)，DC處于失活狀態(tài)，表現(xiàn)為數(shù)量減少及表型和功能上的缺陷[9]。由于DC的生物學(xué)功能是在體內(nèi)遷移的過程中體現(xiàn)的，根據(jù)DC遷移的特點(diǎn)，可以通過介導(dǎo)腫瘤部位招募非成熟DC、激活腫瘤浸潤(rùn)樹突狀細(xì)胞(TIDC)和促進(jìn)已攝取抗原的DC遷移至淋巴結(jié)，以激活CTL來提高腫瘤免疫治療作用[10]。因此如何改善腫瘤局部的免疫抑制微環(huán)境，在腫瘤局部原位募集DC細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞，并使DC遞呈腫瘤抗原，則能誘導(dǎo)CTL特異性殺傷腫瘤細(xì)胞活性。

19世紀(jì)末，William Coley便開始采用混合的細(xì)菌毒素(Coley毒素)來治療惡性腫瘤，Coley毒素即是最早采用的非特異性免疫刺激劑，以后發(fā)展了多種非特異性免疫刺激劑，如卡介苗(BCG)、棒狀桿菌等，尤其是BCG膀胱灌注治療膀胱癌獲得了成功[11]。一些細(xì)菌等非特異性免疫刺激劑依靠很強(qiáng)的抗原性，能激發(fā)和增強(qiáng)機(jī)體的特異與非特異免疫機(jī)能，達(dá)到抗腫瘤作用。同時(shí)血型抗原是一類具有很強(qiáng)的免疫原性和抗原性的同種異型抗原，將其于腫瘤局部注射也將激發(fā)機(jī)體很強(qiáng)的抗血型免疫反應(yīng)。由于二次體液免疫應(yīng)答具有高效、快速等特點(diǎn)，若將抗細(xì)菌、抗血型免疫反應(yīng)和二次免疫應(yīng)答引入腫瘤局部，則可能改善腫瘤局部免疫抑制狀態(tài)，促進(jìn)DC遞呈腫瘤抗原，從而激發(fā)CTL特異性殺傷腫瘤細(xì)胞活性。

本實(shí)驗(yàn)是利用兩種異種抗原(滅活鏈球菌和A型血型抗原)瘤內(nèi)注射并配合全身免疫來治療腫瘤，將抗細(xì)菌、抗血型免疫反應(yīng)和二次免疫應(yīng)答引入腫瘤局部，取得了較為理想的結(jié)果。異種抗原僅全身免疫組和空白對(duì)照組小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)S180細(xì)胞的殺傷作用很弱，主要是它的非特異性細(xì)胞毒作用所致。而異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組的殺傷活性卻很強(qiáng)，異種抗原僅瘤內(nèi)注射組的殺傷活性也有所提高，其抗腫瘤免疫反應(yīng)的機(jī)制可能有以下幾個(gè)方面:①異種抗原與抗體結(jié)合，引起腫瘤局部炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生大量細(xì)胞因子如IL-2、IFN-γ、TNF-α等，它們具有較強(qiáng)的抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用。②聚集Mф細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞和T細(xì)胞等非特異和特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞，NK細(xì)胞和Mф細(xì)胞可直接發(fā)揮抗腫瘤作用，同時(shí)IL-2等可增強(qiáng)其抗腫瘤作用[12]。③隨著腫瘤細(xì)胞萎縮死亡，腫瘤抗原暴露，趨化到腫瘤局部的未成熟DC及TIDC識(shí)別腫瘤抗原，遞呈腫瘤抗原給CD8+T細(xì)胞，CTL活化、增殖，殺傷腫瘤細(xì)胞。

經(jīng)比較兩種異種抗原激活的小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)S180細(xì)胞的殺傷活性，我們發(fā)現(xiàn)A型血型抗原的效果更好一些。血型抗原還具有取材方便、應(yīng)用簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)的不足之處是沒有檢測(cè)腫瘤局部的相關(guān)免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子，尤其是DC細(xì)胞的免疫狀態(tài)，來驗(yàn)證其確實(shí)遞呈了腫瘤抗原，激活了CTL，所以仍需更深入的研究本實(shí)驗(yàn)方法的機(jī)理，并完善此方法。

[1]Sykulev Y，Joo M，Vturina I，et al.Evidence that a single peptide-MHC complex on a target cell can licit A cytolytic T cell response.Immunity，1996，4:565-571.

[2]榮祖元，陳利，朱潔，等.樹突狀細(xì)胞在腫瘤免疫治療領(lǐng)域的研究進(jìn)展.國(guó)外醫(yī)藥抗生素分冊(cè)，2006，27(6):266-268.

[3]鄭婭平，王仁敏.抑癌因子對(duì)小鼠實(shí)體瘤生長(zhǎng)抑制作用研究.腫瘤防治研究，2003，30(3):203-205.

[4]賽燕，劉勇，董兆君.硫芥誘導(dǎo)大鼠脾臟淋巴細(xì)胞凋亡的研究.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2008，33(8):1038-1041.

[5]宋偉慶，韓彩麗，張玉印.人細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞殺傷胃癌細(xì)胞及誘發(fā)凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.腫瘤，2000，20(5):328-330.

[6]陳復(fù)興.腫瘤的細(xì)胞免疫治療.國(guó)外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊(cè)，2004，27(4):197-202.

[7]蔡楓，何貞月.腫瘤微環(huán)境中的樹突狀細(xì)胞及其在腫瘤治療中的作用.東南大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，31(2):225-229.

[8]Sung SY，Hsieh CL，W u D，et al.Tumor microenvironment promotes cancer progression，metastasis，and therapeutic resistance.Curr Probl Cancer，2007，31(2):36-100.

[9]代國(guó)知，袁紅霞，陳虹亮.基于樹突狀細(xì)胞的腫瘤免疫治療研究進(jìn)展.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2012，20(2):409-411.

[10]朱旬.樹突狀細(xì)胞體內(nèi)遷移在腫瘤免疫治療中的作用.國(guó)外醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)分冊(cè)，2005，32(10):748-750.

[11]尚緯.細(xì)菌制劑抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展.天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，12(3):474-476.

[12]王艷，馬穎.Th1/Th2細(xì)胞的免疫功能變化與抗腫瘤免疫.醫(yī)藥論壇雜志，2006，27(22):123-124.