王 道，廖高鵬，肖亞梅

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，教育部蛋白質(zhì)化學(xué)和魚類發(fā)育生物學(xué)重點實驗室，中國 長沙 410081)

巖藻多糖降解酶主要包括3種酶：巖藻多糖酶、α-L-巖藻糖苷酶和硫酸酯酶．α-L-巖藻糖苷酶是一種催化含巖藻糖基的糖蛋白、糖脂等生物活性大分子水解酶的溶酶體酸性水解酶，主要負(fù)責(zé)水解巖藻多糖糖苷鍵的非還原末端的L-巖藻糖殘基，釋放出巖藻糖[1]，廣泛分布于人體和動物的組織細(xì)胞、血液和體液中[2-4]．FUCA1(α-L-巖藻糖苷酶-1)屬于糖基水解酶29家族的一員．FUCA1作為一種同型四聚體，負(fù)責(zé)水解和減少在各種組織中的糖蛋白的部分碳水化合物．研究證實α-L-巖藻糖苷酶基因是小鼠性腺發(fā)育的相關(guān)基因，小鼠精子頂體中的N-乙?；?葡萄糖胺苷酶，被證明參與精卵識別[5]．黃鱔(Monopterusalbus)，屬于硬骨魚綱(Osteichthyes)，合鰓目(Synbranchiformes)，為溫帶淡水魚類，擁有復(fù)雜的生殖發(fā)育過程．黃鱔從受精卵發(fā)育到首次性成熟時是雌性個體，隨后逐漸地發(fā)育為雄性個體，中間的過渡時期為雌雄同體．黃鱔從雌到雄的轉(zhuǎn)變過程被稱為性逆轉(zhuǎn)．黃鱔這種獨特的天然生理現(xiàn)象使它成為研究魚類性別控制機(jī)理的一種重要動物．本研究選用黃鱔(Monopterusalbus)為研究材料，研究FUCA1基因在魚類不同生殖發(fā)育階段中的分化表達(dá)模式，以進(jìn)一步了解和發(fā)現(xiàn)巖藻糖苷酶基因在黃鱔性逆轉(zhuǎn)調(diào)控中的作用，為探究魚類的性別決定機(jī)制提供新線索．

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從湖南省長沙市水產(chǎn)批發(fā)市場購買實驗用黃鱔．選取已經(jīng)達(dá)到性成熟階段的雌、雄黃鱔(雌雄各3尾)，用解剖刀斷頭放血后，迅速用鑷子摘取黃鱔的雌、雄性腺組織，并且用液氮處理后，凍存于-80 ℃的冰箱中備用．

1.2 主要試劑

FUCA1特異引物由上海生物工程公司合成；總RNA提取試劑盒E.Z.N.A Total RNA KitⅡ購自O(shè)mega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First strand cDNA Sythesis Kit購自Fermentas 公司；SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 試劑盒購自Clontech公司；UniQ-10柱式DNA膠回收試劑盒購自上海生物工程公司；PCR Mix 購自北京天根生化科技有限公司；pMD18-T載體購自Takara公司．

1.3 試驗方法

1.3.1 黃鱔FUCA1基因cDNA克隆 首先從黃鱔卵巢組織中用RNA提取試劑盒得到總RNA，然后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAid First strand cDNA Sythesis Kit)做反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以獲取模板cDNA．根據(jù)NCBI的genebank中已經(jīng)報道的人FUCA1基因(GenBank accession number: nm000147.4 )和鼠FUCA1(GenBank accession number: nm024243.4)共同的保守區(qū)，用軟件Primer premier 5.0設(shè)計一對簡并引物E-1和E-2(E-1：5′-TCGGGATTTGGTTGGTG-3′，E-2：5′-CTGGCAAGCTCTGTGGC-3′)．再以cDNA為模板，選用正負(fù)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR反應(yīng)總體積為20 μL (滅菌 water 7 μL，2×Taqmix溶液10 μL，cDNA模板1 μL，正負(fù)引物各1 μL)．PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)熱 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行35 個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，最后4 ℃保存．用1.6%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測目的條帶，用小刀迅速切下目的條帶，回收純化、克隆后送上海生工公司測序．

3′端RACE方法的擴(kuò)增：根據(jù)已經(jīng)獲得的黃鱔FUCA1基因的中間片段設(shè)計特異引物F3OP和F3IP(F3OP：5′-AGTGCTGCTGGAACGGAAATGAC-3′，F(xiàn)3IP：5′-TGTTGGACCGCAGCCAGC-3′)．使用試劑盒SMARTer RACE cDNA Amplification Kit獲取3′的cDNA，吸取1 μL作為模板，用F3OP和10×UPM混合引物(long 0.4 μmol/L 5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′，short 2 μmol/L：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR總體積20 μL (滅菌 water 7 μL，2×Taqmix溶液10 μL，cDNA模板1 μL,正負(fù)引物各1 μL)，PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)熱5 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，5 個循環(huán)； 94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s ，72 ℃ 2 min，5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，25個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min，4 ℃保存．為了提高擴(kuò)增條帶的特異性，將得到的PCR產(chǎn)物稀釋45倍，用移液器取1 μL為模板，然后用引物F3IP和NUP(10 μmol/L：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，總體積20 μL ，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)熱5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存．用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳掃膠，用小刀快速切下目的條帶，克隆后送上海生工公司測序．

1.3.2 RT-PCR檢測FUCA1基因的表達(dá) 已經(jīng)達(dá)到性成熟的黃鱔被斷頭放血數(shù)分鐘后，立即用鑷子摘取2種不同的性腺組織：卵巢和精巢．用OMEGA公司的總RNA提取試劑盒提取不同性腺組織的總RNA．根據(jù)先前已經(jīng)克隆出來的黃鱔FUCA1基因的核苷酸序列用Primer premier 5.0軟件設(shè)計mRNA水平上所需要的表達(dá)引物E-1、E-2(表1)．進(jìn)行PCR反應(yīng)總體積為20 μL (2×Taqmix溶液10 μL，water 6 μL，cDNA模板2 μL，正負(fù)特異引物各1 μL)．PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)熱5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行35 個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃ 保存．最后用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測目的條帶，以β-actin為實驗內(nèi)參．

表1 PCR表達(dá)引物及其引物序列Tab.1 The primers and their sequences of PCR

2 結(jié)果

2.1 黃鱔FUCA1基因核苷酸和氨基酸序列

采用從黃鱔性腺提取的總RNA進(jìn)行RT-PCR．按照已經(jīng)報道的人FUCA1基因(GenBank accession number: nm000147.4)和鼠FUCA1基因(GenBank accession number: nm024243.4)保守序列設(shè)計簡并引物E-1和E-2．用引物E-1和E-2擴(kuò)增出FUCA1部分基因片段，獲得1 200左右的DNA帶，克隆后酶切鑒定、測序，序列長度為1 175 bp序列(圖1)．利用在線軟件SMART對本實驗所克隆出來的FUCA1基因部分序列進(jìn)行對比分析，其結(jié)果表明該序列包含了3個跨膜結(jié)構(gòu)域(圖2)．

圖1 黃鱔FUCA1基因核苷酸及蛋白質(zhì)序列Fig.1 FUCA1 gene nucleotide and amino acid sequence of ricefield eel cDNA

圖2 SMART軟件分析圖Fig.2 SMART software analysis chart

2.2 FUCA1在黃鱔雌雄性腺組織mRNA表達(dá)水平檢測結(jié)果

提取黃鱔的卵巢、精巢，先后進(jìn)行了3次重復(fù)的RT-PCR實驗，檢測了FUCA1基因在不同組織中的表達(dá)，并使用生物軟件GEL-PRO對3次PCR產(chǎn)物的凝膠圖進(jìn)行了半定量灰度分析.PCR擴(kuò)增圖譜顯示，F(xiàn)UCA1基因可在黃鱔的精巢和卵巢組織中檢測到，其在卵巢中的mRNA的表達(dá)量高于在精巢組織(圖3)．

圖3 FUCA1基因在黃鱔2種不同組織中mRNA水平的表達(dá)(1.精巢；2.卵巢)Fig.3 The mRNA expression of FUCA1 in ricefield eel different tissues(1.testis; 2.ovary)

3 討論

目前哺乳動物的Sry基因、雞的Dmrt1基因、青鳉Dmy基因和爪蟾Dm-w基因被認(rèn)為是脊椎動物性別決定的關(guān)鍵基因，研究人員通過分析比對這些脊椎動物的外顯子-內(nèi)含子基因結(jié)構(gòu)，有趣地發(fā)現(xiàn)，青鳉的Dmrt1、Dmy和爪蟾的Dm-w、Dmrt1基因都含有非編碼型的第一外顯子，而小鼠和雞的Dmrt1卻沒有[6]．黃鱔是一類雌性先熟的雌雄同體魚類，其性別發(fā)育方向為單方向進(jìn)行，隨著卵巢的敗育，逐漸過渡到雄性發(fā)育[ 7-8]．20世紀(jì)90年代初，劉建康在研究黃鱔繁殖習(xí)性中首次報道了黃鱔的性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象[9]．但是到目前為止，我們對其性逆轉(zhuǎn)的分子發(fā)育機(jī)制還不甚了解．最新實驗研究表明，動物的性別決定是一個由多基因共同調(diào)控的復(fù)雜過程．在人和哺乳動物性別決定機(jī)制方面，位于Y染色體上的Sry基因被認(rèn)為是性別決定的關(guān)鍵基因[10-11]．周榮家等以人Sry基因序列合成PCR引物，以黃鱔DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并經(jīng)隨機(jī)引物法DIG標(biāo)記的人Sry基因探針進(jìn)行Southern印跡雜交，結(jié)果表明黃鱔基因組存在人的Sry同源基因[12]．在黃鱔的基因組以及cDNA中克隆了兩個Sox9基因，這兩個基因在黃鱔3種性腺中的表達(dá)圖式一致，但是特異地出現(xiàn)在具有雙向分化潛能的性腺上皮的外側(cè)，這提示了它們在黃鱔性反轉(zhuǎn)的性腺分化中有著重要的作用[13-14]．此家族的Sox17基因主要在黃鱔的3種性腺、腦、脾中表達(dá)，表明可能參與黃鱔性逆轉(zhuǎn)[15]．商璇等也發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白93不但具有管家基因的功能，還涉及參與了調(diào)控性腺分化等發(fā)育過程[16]．在黃鱔的不同發(fā)育時期，熒光定量技術(shù)顯示了芳香化酶基因P450arom和P45011β表達(dá)量存在差異，進(jìn)一步說明類固醇在黃鱔性逆轉(zhuǎn)過程中起著重要作用[17]．Dmrt1b基因是目前為止唯一一個硬骨魚類中發(fā)現(xiàn)的，在青鳉魚中起性別決定的基因．研究表明黃鱔中Dmrt1基因在成體性腺中特異表達(dá)，且在性逆轉(zhuǎn)的過程中逐漸升高，說明該基因可能在性反轉(zhuǎn)的過程中有重大的作用[18]．黃鱔性腺發(fā)育過程中，呂道遠(yuǎn)等用RNA反義探針原位雜交技術(shù)，對vasa基因的表達(dá)也進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示黃鱔的雄性生殖細(xì)胞可能起源于雌性階段卵巢被膜中的原始生殖細(xì)胞[19]．在線蟲和果蠅中，vasa基因缺失會導(dǎo)致阻礙卵子正常功能，精子受阻也發(fā)生在vasa基因被敲除的小鼠中[20]．本實驗室之前研究工作證實ERK和JNK在黃鱔卵原細(xì)胞和精原細(xì)胞均有表達(dá)，提示在黃鱔卵母細(xì)胞發(fā)育成熟過程中，ERK和JNK可能起著重要的調(diào)控作用[21]．根據(jù)陳麗莉等報道JNK1基因在黃鱔雌性性腺組織中的表達(dá)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于雄性性腺組織中的表達(dá)量，而JNK3基因在金魚和斑馬魚雌、雄性腺中的表達(dá)結(jié)果是精巢組織中有顯著的表達(dá)，而在卵巢中未檢測到[22]．所有這些都提示著：JNKs家族參與了魚類的性別決定和性腺發(fā)育的調(diào)控過程[23]．

魚類的FUCA1基因研究甚少，F(xiàn)UCA1基因在黃鱔中卵巢的表達(dá)量高于精巢，提示FUCA1基因與黃鱔的性逆轉(zhuǎn)可能有密切關(guān)聯(lián)．同時FUCA1還能夠造成SSEA的表達(dá)量的降低，推測FUCA1可能是調(diào)控SSEA的關(guān)鍵酶．肖亞梅等用免疫組化對黃鱔雌雄性腺SSEA的組織細(xì)胞定位，表明SSEA在黃鱔雄性性腺中的表達(dá)量高于在雌性性腺中的[23]．在黃鱔自然性逆轉(zhuǎn)過程中，是否通過α-L-巖藻糖苷酶這種聚糖途徑對下游的靶基因SSEA的表達(dá)調(diào)節(jié)來控制其生殖發(fā)育呢？α-L-巖藻糖苷酶在黃鱔性逆轉(zhuǎn)過程中的作用機(jī)制有待于更加深入的研究．

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