馬金友，余 燕，劉俊偉，徐之勇，朱巖昆，陳金山

（河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453003）

豬病毒病的暴發(fā)是長(zhǎng)期制約生豬養(yǎng)殖和豬肉產(chǎn)品加工迅速發(fā)展的重要因素之一，尤其是2006年以來豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）變異株引起的高熱病的暴發(fā)使養(yǎng)豬業(yè)遭受了重大經(jīng)濟(jì)損失，因此，通過“預(yù)防為主”，提高豬只的自身免疫能力以增強(qiáng)其抗病力，是解決豬病及抗生素等藥物濫用問題的一條非常有效的途徑。目前，對(duì)于PRRSV免疫預(yù)防研究工作已經(jīng)取得了一些進(jìn)展［1－2］，但對(duì)病毒入侵宿主細(xì)胞后，一些相關(guān)免疫因子對(duì)病毒感染過程中的囊泡運(yùn)輸系統(tǒng)是如何調(diào)控的還知之甚少，尤其在病毒的復(fù)制或參與病毒防御等方面。

Centaurin－α1是Centaurin蛋白家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員，該基因于1996年首先在大鼠腦中被克隆得到，其可以特異性地通過PH結(jié)構(gòu)域與3，4，5－三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3，4，5－trisphosphate，PtdIns（3，4，5）P（3））相結(jié)合，使 Centaurin－α1蛋白向細(xì)胞膜上遷移，通過 Ras－Raf－MEK－ERK1／2途徑調(diào)控細(xì)胞功能，從而參與到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中［3－4］，對(duì)Centaurin－α1的研究主要是其作為ARF6的GAP（GTPase－activating protein）所行使的調(diào)控功能［5］。作為ARF的GAP，Centaurin－α1通過對(duì)ARF的調(diào)控而間接地參與到了病毒和抗病毒感染過程中［6］，同時(shí)，作為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)PI3－K途徑下游的重要成員［4，7］，我們?nèi)钥梢灶A(yù)見，Centaurin－α1可能與豬只抗病毒免疫密切相關(guān)。

由于Centaurin－α1在PRRSV感染中的免疫防御作用和調(diào)節(jié)機(jī)制缺乏了解，本文擬通過豬只Centaurin－α1基因的克隆與分析，構(gòu)建該基因的原核表達(dá)載體以獲得抗血清，為進(jìn)一步研究豬Centaurin－α1在PRRSV感染過程中的調(diào)控作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

1.1.1 常用試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ與HindⅢ、反轉(zhuǎn)錄酶 M－MLV、Taq DNA 聚合酶，pMD18－T載體、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA回收試劑盒、PrimeSTARTMHS DNA Polymerase，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖、蛋白胨和酵母浸出膏等，購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；槍頭和離心管（Axygen），購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；pET－His載體和大腸桿菌（Escherichia coli Top10）由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要設(shè)備 PCR儀，凝膠成像系統(tǒng)，水平電泳槽，電泳儀，超凈工作臺(tái)，臺(tái)式冷凍離心機(jī)，隔水式恒溫培養(yǎng)箱，恒溫?fù)u床，電子精密天平，高壓滅菌鍋，制冰機(jī)等。

1.2 材料 從動(dòng)物科學(xué)學(xué)院獸醫(yī)院取疑似PRRSV感染的杜洛克豬肺、腦、淋巴結(jié)、心臟等少量組織，液氮凍存帶回實(shí)驗(yàn)室處理。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI（National Center for Biotechnology Information）豬 Centaurin－α1（M ＿214226）序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增Centaurin－α1全長(zhǎng)ORF引物（CentF：5′－ATGGCCAA－GGAGCGGCGG－3′ 和CentR：5′－CGCTAGGGTTTATGC－TTGAAGTG－3′，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成）和原核表達(dá)引物（Sus－CenF1：5′－GCGAATTCATCTGCCTGAGCTGCTTG－3′ 和 SusCenR1： 5′－CGAAGCTTCGCTAGGGTTTATG－CTTGAAG－3′，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司法合成，下劃線為酶切位點(diǎn)）。

1.4 方法

1.4.1 豬Centaurin－α1基因擴(kuò)增

1.4.1.1 組織總RNA提取 取適當(dāng)組織（200mg以下）于研缽（180℃烘烤3h）中加入液氮充分研磨，然后加入1 000μL Trizol（Invitrogen）混勻，分裝為2管，再分別加入Trizol補(bǔ)充至每管1 000μL，混勻（1管凍存，1管用于試驗(yàn)），室溫放置10min；12 000r／min（4℃）離心10min；上清轉(zhuǎn)移至一新管，加入0.2mL氯仿／每1 000μL Trizol，劇烈搖動(dòng)15s左右，室溫放置8min左右；12 000r／min（4℃）離心15min；上層水相轉(zhuǎn)移至一新管中，加入0.5 mL異丙醇混勻，室溫放置8min；12 000r／min（4℃）離心8min；棄上清，1mL 75%乙醇洗1min，7 500r／min（4℃）離心5min，重復(fù)洗1次；棄上清，空氣干燥3min，加入60μL DEPC水溶解沉淀。

1.4.1.2 cDNA合成 首先配制以下成分：1μL 6 mer隨機(jī)引物，4μg 總 RNA，1μL 10mmol／L dNTP混合物，DEPC水補(bǔ)充到14μL；PCR儀中65℃加熱5min，然后冰浴至少1min；輕微離心一下，然后加入以下成分：4μL 5×first－strand Buffer，1μL Rnase inhibitor，1μL反轉(zhuǎn)錄酶 M－MLV；PCR儀中25℃溫浴5min，42℃溫浴60min，70℃加熱15min以失活成分，4℃后保存冰箱中備用。

1.4.1.3 Centaurin－α1基因擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)管中分別加入以下成分：5×Prime－STARTMBuffer 5 μL，2.5mmol／L dNTP混合物2μL，上下游引物各1.0μL，10倍稀釋的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.0μL，PrimeSTARTMHS DNA Polymerase 0.25μL，補(bǔ)充滅菌三蒸水至25μL。PCR反應(yīng)程序如下：95℃，3min；98℃10s，55℃15s，72℃70s，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min，4℃終止。

1.4.2 基因擴(kuò)增產(chǎn)物的回收、連接和測(cè)序 檢測(cè)擴(kuò)增的目的片段，根據(jù)DNA回收試劑盒說明回收目的片段；0.5mL離心管中依次加入：載體（pMD18－T）0.5L，目的片段6.0L，10×Liga－tion Buffer 1.0L，T4Ligase 0.6L，滅菌三蒸水補(bǔ)充至10.0 L，16℃連接6h；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top 10細(xì)菌和轉(zhuǎn)化細(xì)菌的檢測(cè)及測(cè)序，正確測(cè)序產(chǎn)物質(zhì)粒的提取、保存。

1.4.3 序列分析 分別運(yùn)用 Clustal X［8］和 Blast程序 （http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／blast／）及Signal P 4.0 （http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）分析核酸序列和預(yù)測(cè)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域及信號(hào)肽。通過 MEGA 4.0［9］程序的鄰接法（Neighbor－Joining，NJ，bootstrap1000）構(gòu)建了相關(guān)物種Centaurin－α1的系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.4.4 豬 Centaurin－α1融合蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

1.4.4.1 Centaurin－α1基因表達(dá)序列的擴(kuò)增 除擴(kuò)增引物為SusCenF1和SusCenR1及模板為提取含Centaurin－α1序列質(zhì)粒外，其他成分和程序參照1.4.1.3的成分和步驟。

1.4.4.2 擴(kuò)增的 Centaurin－α1序列和連接載體酶切及回收 1.5mL Eppendorf管中分別依次加入：內(nèi)切酶緩沖液（10xK）5.0L；DNA片段和pET－His分別為43.0L；EcoRⅠ1.0L，HindⅢ1.0L，37℃酶切2.5h。酶切后的片段回收按照DNA回收試劑盒說明進(jìn)行。

1.4.4.3 載體和目的片段連接、轉(zhuǎn)化及檢測(cè) 0.5 mL離心管中依次加入：酶切載體（pET－His）1.5 L，待連接的酶切 Centaurin－α1片段6.5L，10×Ligation Buffer 1.0L，T4Ligase 1.0μL，總體積10.0L，16℃連接6h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top 10細(xì)菌，轉(zhuǎn)化細(xì)菌的菌落檢測(cè)和質(zhì)粒雙酶切檢測(cè)驗(yàn)證，符合要求的菌落測(cè)序，正確測(cè)序產(chǎn)物質(zhì)粒的提取、保存。

2 結(jié)果

2.1 豬Centaurin－α1基因ORF的克隆與分析

2.1.1 豬Centaurin－α1基因ORF的克隆 通過豬腦和肺臟組織總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄和基因的擴(kuò)增，得到了和目的基因一致的條帶（圖1），測(cè)序后確認(rèn)為豬Centaurin－α1基因，大小為1 100bp左右。

圖1 克隆的豬Centaurin－α1電泳圖

圖2 豬Centaurin－α1基因全長(zhǎng)序列和蛋白序列中的保守結(jié)構(gòu)域

2.1.2 豬Centaurin－α1基因ORF及結(jié)構(gòu)特征 豬Centaurin－α1基因包含一個(gè)長(zhǎng)度為1 122bp開放閱讀框，預(yù)測(cè)編碼374個(gè)氨基酸，理論分子質(zhì)量約為43.50kDa，pI為8.95（圖2，A）。

通過NCBI Blast尋找其序列中的保守結(jié)構(gòu)域，我們發(fā)現(xiàn)，豬Centaurin－α1蛋白包含一個(gè)Arf GAP和兩個(gè)PH結(jié)構(gòu)域（圖2，B）。信號(hào)肽預(yù)測(cè)該蛋白前22個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列。

2.1.3 豬Centaurin－α1分子系統(tǒng)分析 根據(jù) Centaurin－α1氨基酸序列構(gòu)建的 NJ樹（Neighbor－Joining tree）顯示：該蛋白首先與牛 Centaurin－α1聚為一類，說明其與牛Centaurin－α1親緣關(guān)系較近，這從它們同為偶蹄目動(dòng)物能夠得到進(jìn)一步的證實(shí)，與哺乳動(dòng)物中人和嚙齒目動(dòng)物也有較高的同源性，而和魚綱中的斑馬魚和兩棲類的非洲爪蛙親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)（圖3）。

圖3 構(gòu)建的豬Centaurin－α1NJ樹

2.2 豬Centaurin－α1融合蛋白原核表達(dá)載體構(gòu)建由于Centaurin－α1是細(xì)胞中調(diào)控囊泡運(yùn)輸?shù)鞍椎闹匾蜃樱瑢?duì)病毒的入侵起著重要的調(diào)控作用，為了獲得抗血清進(jìn)一步研究它的功能，對(duì)其原核表達(dá)載體進(jìn)行構(gòu)建。通過設(shè)計(jì)的原核表達(dá)引物經(jīng)PCR從質(zhì)粒pMD18－T－Centaurin－α1中克隆表達(dá)序列，雙酶切后連接到pET－His載體上，通過菌落PCR獲得了和目的片段大小一致的條帶，挑選的菌落培養(yǎng)后提取的質(zhì)粒雙酶切圖譜（圖4）進(jìn)一步證實(shí)構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體的正確性。根據(jù)克隆的Centaurin－α1基因，我們成功構(gòu)建了豬Centaurin－α1原核表達(dá)載體用于融合蛋白的表達(dá)。

圖4 構(gòu)建的豬Centaurin－α1融合蛋白表達(dá)載體雙酶切

3 討論

PRRSV是影響世界豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要流行性傳染病之一，具有導(dǎo)致懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)和死胎等嚴(yán)重病癥特點(diǎn)，尤其2006年后該病的暴發(fā)使養(yǎng)豬業(yè)遭受了重大損失。在研究中發(fā)現(xiàn)PRRSV感染早期豬Centaurin－α1基因表達(dá)明顯上調(diào)，說明豬Centaurin－α1因子可能參與了早期病毒感染的防御作用。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于Centaurin蛋白家族的報(bào)道還非常少，作為這個(gè)家族中最早被發(fā)現(xiàn)的成員，Centaurin－α1在人們的研究中大多數(shù)都還僅限于它與ARF6的關(guān)系。然而，從Centaurin－α1蛋白所具有的保守結(jié)構(gòu)域上，我們不難看到該蛋白可能具有的功能和作用是不容忽視的。因?yàn)镃entaurin－α1不僅可以作為ARF6的GAP，從而間接參與到細(xì)胞吞噬、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)然顒?dòng)中，它擁有的兩個(gè)PH結(jié)構(gòu)域及可與第二信使3，4，5－三磷酸磷脂酰肌醇特異性結(jié)合的能力也暗示了它可能在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要地位。而且，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Centaurin－α1可能是重要細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑PI3－K途徑下游的成員［7］，盡管目前在這方面還沒有具體的研究，但是我們?nèi)允强梢灶A(yù)見Centaurin－α1可能與豬的相關(guān)病毒入侵有著密切的相關(guān)性。

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