肖新才，官亞蘭，王振環(huán)，杜歡歡

(中南民族大學(xué)藥學(xué)院，武漢430074)

殼聚糖(chitosan)是天然生物大分子甲殼素N－脫乙酞基的衍生物，它不僅具備良好的生物活性［1，2］、生物相容性、體內(nèi)可降解性以及成膜性能［3］，還具有消炎、抗菌、止血和抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等特殊功能，因而以CS為原料制備微囊成為靶向給藥的新熱點(diǎn)，并廣泛應(yīng)用于藥物控釋［4］、酶的固定化［5］、細(xì)胞的包埋［6］等領(lǐng)域.但目前關(guān)于殼聚糖的微球或微囊的的方法多以醛類(lèi)(如戊二醛、甲醛)為交聯(lián)固化劑，這種交聯(lián)劑有毒，且該法對(duì)制備蛋白質(zhì)和肽類(lèi)藥物應(yīng)用受限［7］.

殼聚糖與多聚磷酸鈉(TPP)是兩種分別帶正電荷與負(fù)電荷，無(wú)毒、生物相容性好、可生物降解的天然高分子材料，因良好的成膜性被廣泛用于藥物載體等領(lǐng)域［8］.離子凝膠法是利用多聚磷酸鈉對(duì)殼聚糖進(jìn)行離子誘導(dǎo)凝膠化而制備納米粒，通過(guò)殼聚糖醋酸溶液和多聚磷酸鈉水溶液的濃度差和兩水相混合物的離子凝結(jié)作用形成微囊.

水包水乳液是將水溶性聚合物在分散劑的作用下分散到水溶性介質(zhì)中制得的聚合物乳液［9］，它以水為介質(zhì)，在分散劑和穩(wěn)定劑的作用下合成的聚合物以微粒狀穩(wěn)定存在水溶液中，較油包水乳液固含量大、黏度低，可直接稀釋，在聚合和使用中無(wú)有機(jī)溶劑污染，具有廣闊的應(yīng)用前景和環(huán)保價(jià)值［10］.

離子凝膠化法中各個(gè)反應(yīng)條件對(duì)微膠囊的影響較大［7］，不易形成穩(wěn)定且形貌較好的微囊.水包水乳液法制備殼聚糖微囊在國(guó)內(nèi)外期刊中少見(jiàn)有報(bào)道，本文選用CS和TPP作為反應(yīng)材料，既避免了化學(xué)交聯(lián)劑所帶來(lái)的毒性的影響，而且能夠得到形貌相對(duì)較好，且比較穩(wěn)定的殼聚糖微囊［11］.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

殼聚糖(CS，武漢及時(shí)雨科技有限公司)，多聚磷酸鈉(TPP，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，吐溫80(Tween-80，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，聚乙二醇20000(PEG 20000，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，冰醋酸(HAc，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司).

聚熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101S型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，透射電子顯微鏡(TecnaiG2 20S-TWIN，F(xiàn)EI公司)，電子天平(AR2140型，上海奧豪斯儀器有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法和制備原理

1.2.1 制備原理

殼聚糖和多聚磷酸鹽的結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1，殼聚糖分子中含有大量的-NH2［12］，酸溶液中被質(zhì)子化，形成-而溶解;多聚磷酸鈉分子上的多個(gè)負(fù)電基團(tuán)可與殼聚糖分子中的大量-形成分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)［13］，使殼聚糖分子沉析出來(lái).由于TPP中含有多個(gè)PO-Na+基團(tuán)，溶解于醋酸的殼聚糖分子鏈中含有，殼聚糖在酸性條件下發(fā)生質(zhì)子化，伸展成線狀，氨基暴露出來(lái)并變成帶正電的-，與TPP中的-PO-結(jié)構(gòu)單元通過(guò)靜電作用聚合成囊［7］，二者發(fā)生反應(yīng):chitosan-+TPP-PO-→chitosan---OP-PP.并向殼聚糖溶液中加了Tween-80和PEG20000，使分散劑和助表面活性劑在殼聚糖和多聚磷酸鈉這兩種“水包水”溶液中形成界面膜，令水包水溶液反應(yīng)更好的進(jìn)行.

圖1 殼聚糖和多聚磷酸鈉的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of chitosan and sodium polyphosphate

1.2.2 殼聚糖的預(yù)處理

稱取一定量的殼聚糖粉末溶于冰醋酸水溶液中，37℃的恒溫水浴中用恒溫磁力攪拌器攪拌1h，用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值.冷卻至室溫，待氣泡完全消失，4℃靜置24 h，過(guò)濾備用.

1.2.3 傳統(tǒng)離子凝膠化法殼聚糖微膠囊

將配制好的殼聚糖溶液倒入250 mL的3口燒瓶，25℃的恒溫水浴中固定至恒速攪拌器上，通過(guò)滴液漏斗向殼聚糖醋酸溶液中緩慢滴加多聚磷酸鈉溶液，低速攪拌，制得殼聚糖微膠囊.

1.2.4 “水包水”法制備殼聚糖微膠囊

將已經(jīng)配制好的殼聚糖溶液倒入250 mL的3口燒瓶中，25℃的恒溫水浴中固定至恒速攪拌器上，加入600 μL的Tween-80和一定量助表面活性劑PEG 20000，在1500 r/min的轉(zhuǎn)速下高速攪拌30 min，使三者充分混合均勻.通過(guò)滴液漏斗向殼聚糖醋酸溶液中緩慢滴加多聚磷酸鈉溶液，低速攪拌，制得殼聚糖微膠囊.

1.2.5 微膠囊形貌及粒徑的分析表征

微膠囊的形貌和粒徑是其兩個(gè)重要的參數(shù)，本實(shí)驗(yàn)采用透射電子顯微鏡(TEM)觀察微膠囊的結(jié)構(gòu)和粒徑.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同CS和TPP質(zhì)量密度比對(duì)殼聚糖微囊成囊的影響

TPP是為反應(yīng)的交聯(lián)劑，為帶正電荷的殼聚糖提供負(fù)電荷，通過(guò)二者之間的靜電相互作用而成囊，故TPP的加入量，即TPP與CS的濃度的比會(huì)影響CS/TPP納米微膠囊的成囊效果.不同濃度比的CS/TPP TEM 圖見(jiàn)圖2.由圖2 可見(jiàn)，ρ(CS)=1.50 mg/mL，ρ(TPP)=0.50 mg/mL，即 ρ(CS)︰ ρ(TPP)=3︰1時(shí)，成囊效果較好.

圖2 不同濃度比的CS和TPP時(shí)微囊的TEM圖Fig.2 TEM images of the microcapsules with different concentration ratio of chitosan and tripolyphosphate

2.2 不同體積分?jǐn)?shù)的醋酸對(duì)溶劑殼聚糖微囊成囊的影響

殼聚糖是自然界中唯一的堿性多糖，不溶于水及一般有機(jī)溶劑，但在有機(jī)酸的水溶液(pH＜6.5)中能溶解形成粘性溶液.作為反應(yīng)的主要反應(yīng)物，它的溶解度也會(huì)對(duì)成囊的多少帶來(lái)很大影響.從圖3中可見(jiàn)用體積分?jǐn)?shù)為10%的醋酸為溶劑時(shí)，形成的膠囊較好，數(shù)量較多，因?yàn)楦嗟臍ぞ厶侨芙饪商峁└嗟?NH+3與TPP-PO-靜電作用成囊.

圖3 不同體積分?jǐn)?shù)的醋酸作溶劑時(shí)微囊的TEM圖Fig.3 TEM images of the microcapsules with different volume fraction of acetic acid as solvent

2.3 不同攪拌速度對(duì)殼聚糖成囊的影響

在制備微囊的過(guò)程中，若攪拌速度過(guò)大，易使殼聚糖和多聚磷酸根之間靜電作用斷裂，不利于二者凝結(jié)成囊，不同攪拌速度下制備微囊的TEM圖見(jiàn)圖4.由圖4可見(jiàn)，當(dāng)轉(zhuǎn)速為300，400 r/min時(shí)，相比200 r/min時(shí)，微囊的成型性較好，但更高轉(zhuǎn)速下幾乎無(wú)微囊形成.或因轉(zhuǎn)速過(guò)高，阻礙了殼聚糖中氨基正離子和多聚磷酸鈉中磷酸根負(fù)離子的凝結(jié)聚合，無(wú)法交聯(lián);或因高速轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)溶液的過(guò)大的剪切力使形成的薄壁微囊破碎.

2.4 Tween-80對(duì)殼聚糖成囊的影響

圖4 不同轉(zhuǎn)速時(shí)微囊的TEM圖Fig.4 TEM images of the microcapsules with different stirring speeds

分散劑的加入，有助于“水包水”溶液中的介質(zhì)更好的分散而不易黏粘，加入和未加分散劑的微囊TEM圖見(jiàn)圖5.由圖5中可見(jiàn)，加入 Tween-80和PEG 20000后，微囊的形態(tài)和粘黏性均較未加更好，說(shuō)明帶正電荷的殼聚糖和帶負(fù)電荷的多聚磷酸根能在Tween-80和PEG 20000形成的“界面膜”上更好地凝結(jié)成囊.

圖5 有無(wú)分散劑和助表面活性劑時(shí)TEM圖Fig.5 TEM images of microcapsules with or without dispersant and cosurfactant

2.5 PEG20000的加入量對(duì)殼聚糖成囊的影響

PEG 20000的加入有助于降低界面張力，增加界面的柔韌性，使界面易于彎曲，有助于微乳形成［14］，不同質(zhì)量的 PEG 20000形成的微囊圖見(jiàn)圖6.由圖6可見(jiàn)，隨著PEG 20000質(zhì)量的增加，帶正電荷的殼聚糖和帶負(fù)電荷的多聚磷酸根在“界面膜”處通過(guò)靜電作用而凝結(jié)成囊，這種作用使分散劑所形成的“界面膜”彎曲趨向球形，穩(wěn)定性和單分散性增加.說(shuō)明助表面活性劑的加入有助于殼聚糖微囊的形成，并能增加微囊的單分散性.

圖6 不同質(zhì)量聚乙二醇20000下微囊的TEM圖Fig.6 TEM images of the microcapsules with different qualities of PEG 20000

2.6 攪拌速度對(duì)殼聚糖微囊成囊的影響

不同攪拌速度下微囊的TEM圖見(jiàn)圖7.圖7中b)、c)中轉(zhuǎn)速稍偏大，所形成的微囊型不好，由于攪拌速度過(guò)大阻礙了殼聚糖中氨基正離子和多聚磷酸鈉中磷酸根負(fù)離子的凝結(jié)聚合，導(dǎo)致無(wú)法很好的靜電凝結(jié).

圖7 轉(zhuǎn)速不同時(shí)微囊的透射電子顯微鏡圖Fig.7 TEM images of the microcapsules with different stirring speeds

2.7 pH值對(duì)殼聚糖微囊制備的影響

由于殼聚糖粘度較大不溶于水，pKa一般約為6.5，反應(yīng)的 pH 值必須小于 6.5［15］.在酸性條件下，殼聚糖分子上的-NH2質(zhì)子化而帶正電荷，微囊化過(guò)程中，體系pH一般控制在3～6.實(shí)驗(yàn)中用乙酸對(duì)其溶解，故酸度對(duì)納米膠囊的制備和成型均有一定的影響.不同pH下所形成的微囊如圖8所示.由圖8可見(jiàn)，pH=5.11時(shí)殼聚糖微囊的形貌較pH=3.00時(shí)更好，由于在pH較低時(shí)，殼聚糖的電離基本上被抑制.

圖8 不同pH所形成的微囊的TEM圖Fig.8 TEM images of the microcapsules with different pH

3 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化一種離子凝膠化成囊的方法，即“水包水”型離子凝膠法，在“水包水”溶液中形成一種“界面膜”的作用，由殼聚糖醋酸溶液和多聚磷酸鈉水溶液二者的濃度差和用兩水相混合物的離子凝結(jié)作用形成微囊.結(jié)果表明:在600μL分散劑Tween-80和0.0400g助表面活性劑PEG 20000的介質(zhì)中，當(dāng)轉(zhuǎn)速為200 r/min，pH=5.11，ρ(CS)=1.50 mg/mL，ρ(TPP)=0.50 mg/mL，即 ρ(CS)︰ ρ(TPP)=3︰1時(shí)，成囊較好.但對(duì)微膠囊的形狀、大小、均一性、單分散性等問(wèn)題還需要進(jìn)一步的研究.

［1］Rabea E I，Badawy M E-T，Stevens C V，et al.Chitosan asantimicrobial agent:applications and mode of action［J］.Biomacromolecules，2003，4(6):1457-1465.

［2］Sogias I A，Williams A C，Khutoryanskiy V V.Why is chitosan mucoadhesive［J］.Biomacromolecules，2008，9(7):1837-1842.

［3］Francis Suh J K，Matthew H W T.Application of chitosanbased polysaccharide biomaterials in cartilage tissue engineering:a review［J］.Biomaterials，2000，21(24):2589-2598.

［4］Shi X Y，Tan T W.Preparation of chitosan/ethylcellulose complex microcapsule and its application in controlled release of Vitamin D2［ J］.Biomaterials，2002，23(23):4469-4473.

［5］Haque T，Chen H，Ouyang W，et al.Investigation of a new microcapsule membrane combining alginate，chitosan，polyethylene glycol and poly-L-lysine for cell transplantation applications［J］.Int J Arti Organs，2005，28(6):631-637.

［6］Taqieddin E，Amiji M.Enzyme immobilization in novel alginate-chitosan core-shell microcapsules［J］.Biomaterials，2004，25(10):1937-1945.

［7］楊文靜，王 婷，何農(nóng)躍.CS/TPP納米微膠囊的制備及其載藥性能［J］.高等化學(xué)學(xué)報(bào)，2009，3(30):625-628.

［8］邢 楠.殼聚糖基蛋白質(zhì)固定化載體的制備及其性能研究［D］.北京:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)學(xué)院，2007，1-101.

［9］王玉峰，胡惠仁.水分散聚合法制備陽(yáng)離子聚丙烯酰胺水包水乳液［J］.中國(guó)造紙學(xué)報(bào)，2008，23(2):75-78.

［10］馬 斐，王 穎，李國(guó)麟，等.水包水聚丙烯酸乳液的合成研究［J］.廣東化工，2010，37(12):43-44.

［11］Jonassen H，Kjoniksen A L，Hiorth M.Stability of chitosan nanoparticlescross-linked with tripolyphosphate［J］.Biomacromoleculed，2012，13(11):3747-3756.

［12］Wu Chen，Pan Jilun，Bao Zhiming，et al.Fabrication and characterization of chitosan microcarrier for hepatocyte culture［J］.J Materials Sci Mater Med，2007，18(11):2211-2214.

［13］周 燕，劉寶林，韓寶三，等.多聚磷酸鈉 /殼聚糖多孔微載體的制備研究［J］.中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào)，2010，29(4):636-640.

［14］Lawrence M J，Rees G D.Microemulsion-based media as novel drug delivery systems［J］.Adv Drug Deliv Rev，2000，45(1):89-121.

［15］魏譚軍，董德剛，裘 梁，等.離子交聯(lián)法制備殼聚糖納米顆粒［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(5):2885-2886.