李 勁，高 奎，李可可，劉 瀏，劉學(xué)群

(中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢430074)

禽類多瘤病毒(APV)，早期稱鸚鵡幼雛病病毒(BFDV)，能引起多種鸚鵡雛鳥死亡的急性病毒性傳染病，主要感染出殼1～3周的鸚鵡，死亡率高達(dá)80%，并感染其他多種鳥禽［1-3］.在禽流感向全世界蔓延不斷有死亡報(bào)道和人傳人的可能性不斷增高的情況下，禽類的人禽共患病和病原學(xué)正得到廣泛研究.

對(duì)APV-1的晚期基因編碼的前導(dǎo)蛋白Agno-1(1a 和1b)和 Agno-2(2a 和2b)［4-7］的結(jié)構(gòu)和功能的研究發(fā)現(xiàn):Agno-1a是一種病毒外殼蛋白VP4［8-9］并與Agno-1b一起導(dǎo)致雞胚成纖維細(xì)胞的凋亡，其全基因組線性圖見(jiàn)圖1［10］.APV-1晚期基因多順?lè)醋觤RNA中下游VP3基因的翻譯以“Leaky Scanning”模式進(jìn)行，即40S核糖體亞基-翻譯起始復(fù)合物忽視上游VP1的mRNA起始位點(diǎn)并滑到下游VP3的mRNA起始位點(diǎn)，繼而進(jìn)行VP3蛋白的翻譯.

本文為研究APV-1晚期基因多順?lè)醋觤RNA下游VP1基因的翻譯調(diào)控機(jī)制，設(shè)計(jì)含AUG起始碼的編碼7個(gè)氨基酸的具有最佳翻譯起始信號(hào)的核苷酸插入到agno-1a mRNA的上游(見(jiàn)圖2)，以觀察其對(duì)agno-1a mRNA下游VP1翻譯的影響.

圖1 禽類多瘤病毒全基因組線性圖Fig.1 The genome map of Avian polyomavirus

圖2 pHL1003 cDNA質(zhì)粒插入APV-1 agno區(qū)片段示意圖Fig.2 Schematic diagram of pHL1003 cDNA plasmid with inserts of APV-1 agno region

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

pHL1003，APV-1的 cDNA質(zhì)粒(見(jiàn)圖3，ango區(qū)域只含agno-1a，除去intron-4而缺失小t基因，德國(guó)Giessen大學(xué)Gerd Hobom教授提供)，大腸桿菌DH10b(武

漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)，DNA Marker、ATP、Tag-DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶 Acc I、Bam HI、T4-DNA連接酶(Takara公司)，凝膠回收試劑盒(Axygen公司)，其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純.PCR引物(見(jiàn)圖2，上海桑尼生物科技有限公司合成):99-sense(TCCAAATAAGGGAATGCG)，359-Antisense(CGGAGTGCTAAACGGGCTAA);插入片段引物 41(CTACTCCAGCCCGGGATTCCACTATGG)，42(GATGAGGTCGGGCCCTAAGGTGATACC).DNA測(cè)序(上海桑尼生物科技有限公司).

1.2 方法

圖3 pHL1003 cDNA質(zhì)粒圖譜Fig.3 The plasmid map of pHL1003 cDNA

1.2.1 pHL1003 的中量制備

［11］，挑?。?0℃超低溫冰箱保存的菌液接種于1mL含amp的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃，220r/min條件下培養(yǎng)12 h，將新鮮培養(yǎng)的1 mL菌液接種于200 mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中在37℃，220r/min條件下培養(yǎng)12 h，采取改進(jìn)的堿裂解法提取DNA，將提取的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，保存于－20℃冰箱.

1.2.2 酶切質(zhì)粒pHL1003獲取目的片段

冰上操作，用AccⅠ部分酶切，按下列體系加樣:10 × M buffer 20 μL，Acc I 0.5μL，pHL1003 DNA 100μL，ddH2O 79.5 μL，37℃ 酶切 50min.

1.2.3 插入片段41，42 DNA的退火形成和磷酸化處理

將等摩爾濃度的合成引物41，42溶液1︰1混合后加溫至95℃，維持5min后緩慢降至室溫.DNA的磷酸化體系如下:T4 Polynucleotide Kinase 2μL，AIP 2 μL，41，42 DNA 30 μL，10 × T4 polynucleotide kinase buffer 5μL，ddH2O 11μL，37℃水浴12 h，插入片段 41，42 DNA磷酸化后用 3M的 CH3COOK沉淀.

1.2.4 禽類多瘤病毒克隆的構(gòu)建

用T4 DNA連接酶(16℃過(guò)夜)連接Acc I酶切回收后的pHL1003大片段和經(jīng)磷酸化處理后的目的插入片段，熱休克法(42℃)轉(zhuǎn)化CaCl2制備的感受態(tài)E.coli DH10b，37℃ LB液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)1 h后涂布于含Amp的LB平板進(jìn)行篩選，選擇陽(yáng)性重組菌落進(jìn)行質(zhì)粒小量制備.

1.2.5 PCR和PAGE篩選重組質(zhì)粒

以小量制備的重組DNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增，檢測(cè)是否有片段插入.PCR體系總體積50 μL，含無(wú)菌水40.5μL，10 × buffer 5μL，10 μmol/L 正反向引物各 0.25 μL，1 mmol/L dNTP 1.5 μL，0.25 U/μL Tag 聚合酶 1.5 μL，重組 DNA 模板 1 μL.PCR程序:94℃ 5min;94℃ 1min，49℃ 1min，72℃ 1min，30個(gè)循環(huán);72℃ 10min.8%的 PAGE凝膠檢測(cè)，EB染色，凝膠成像儀拍照.對(duì)含有插入片段的目的克隆進(jìn)行DNA測(cè)序.

2 結(jié)果與分析

pHL1003 DNA的1%瓊脂糖凝膠電泳，Acc I部分酶切和陽(yáng)性克隆的PCR結(jié)果分別見(jiàn)圖4～5.采取堿裂解法中量制備質(zhì)粒DNA，由圖4電泳檢測(cè)可見(jiàn)在7.5kb處有2條明顯的條帶，說(shuō)明提取的DNA效果較好.以此用Acc I部分酶切(見(jiàn)圖5)在約7.5kb處有2條帶，上面的是所需要的目的條帶，下面的是Acc I的2個(gè)臨近酶切位點(diǎn)的雙酶切產(chǎn)物.將目的片段回收后與磷酸化處理后的插入片段連接并轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性克隆，堿裂解法小量制備后，PCR擴(kuò)增插入片段兩側(cè)260 bp的DNA片段，經(jīng)8%PAGE檢測(cè)(見(jiàn)圖6)，挑選含有插入片段的克?。?2］并測(cè)序.

圖4 pHL1003 DNA的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.4 1%Agarose gelelectrophoresis results of pHL1003 DNA

圖5 pHL1003 DNA的Acc I部分酶切結(jié)果Fig.5 The result of pHL1003 DNA partially digested by Acc I

圖6 陽(yáng)性克隆的PCR結(jié)果Fig.6 The PCR result of the positive clones

3 測(cè)序結(jié)果

APV-1 cDNA克隆及其突變體的agno-1a基因編碼起始區(qū)測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖7.由圖7可見(jiàn)，Agno-1a(0)為正常APV-1 cDNA克隆pHL1003，Agno-1a(+1)和Agno-1a(+2)分別為含有1個(gè)和2個(gè)插入片段的克隆.另外，意外得到Agno-1a(+1')、Agno-1a(+2')、Agno-1a(+2')、Agno1a(+3')、Agno1a(+4')這5個(gè)突變克隆，分別含有1個(gè)，2個(gè)，2個(gè)(不同于前者)，3個(gè)，4個(gè)插入片段的克隆.

4 討論

蛋白質(zhì)翻譯的過(guò)程是基因表達(dá)的第二階段，其翻譯起始(特別是多順?lè)醋拥姆g起始)調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜.目前已知的主要有2種多順?lè)醋臃g起始調(diào)控方式:①掃描機(jī)制(leaky scanning)依賴于帽子結(jié)構(gòu)的mRNA以CCRCCAUGG作為最佳的翻譯起始密碼子序列.40S核糖體亞基起始復(fù)合物結(jié)合至mRNA帽子結(jié)構(gòu)區(qū)并沿mRNA向下游掃描搜索，借助CCRCCAUGG序列搜尋具較強(qiáng)信號(hào)的起始密碼子，以此序列的－3和+4位(斜體帶下劃線字母)決定起始的強(qiáng)度和翻譯效率的高低;②內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列 (internal ribosome entry site，IRES)［13］，在小RNA病毒家族中發(fā)現(xiàn)，mRNA無(wú)帽子結(jié)構(gòu)，GC含量較高，5'UTR較長(zhǎng)，可能存在復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，編碼多種蛋白質(zhì)，存在多個(gè)起始密碼子，這些特點(diǎn)令40S核糖體亞基起始復(fù)合物難以通過(guò)leaky scanning方式起始翻譯，而以40S核糖體起始復(fù)合物直接結(jié)合于mRNA-AUG區(qū)域的方式起始翻譯.

圖7 APV-1 cDNA克隆及其突變體的agno-1a基因編碼起始區(qū)序列Fig.7 Agno-1a gene coding sequences with ATG of APV-1 cDNA clone and its mutants

禽類多瘤病毒APV-1與其他多瘤病毒基因組的組成和結(jié)構(gòu)類似，分為早期區(qū)、晚期區(qū)及非編碼調(diào)控區(qū).晚期編碼區(qū)可轉(zhuǎn)錄出多種多順?lè)醋觤RNA，分別翻譯出 Agno-1a、Agno-1b、Agno-2a、Agno-2b、VP1、VP2、VP3.

對(duì)APV的晚期基因編碼的前導(dǎo)蛋白Agno-1(1a和1b)和Agno-2(2a和2b)的結(jié)構(gòu)和功能的深入研究發(fā)現(xiàn)這些Agno蛋白與禽類多瘤病毒的復(fù)制和晚期蛋白的表達(dá)有關(guān)［14］.本研究通過(guò)在agno-1a基因編碼區(qū)的翻譯起始點(diǎn)插入含AUG起始碼的編碼7個(gè)氨基酸的具有最佳翻譯起始信號(hào)的核苷酸，成功構(gòu)建了不同的APV-1 cDNA克隆突變體，為在細(xì)胞內(nèi)觀察其對(duì)agno-1a mRNA下游VP1翻譯的影響，進(jìn)一步研究禽類多瘤病毒晚期基因的翻譯調(diào)控分子機(jī)制打下了良好的基礎(chǔ).

參考文獻(xiàn)

［1］夏 葦，馮 鋒，李天憲，等.我國(guó)一株鸚鵡病毒的鑒定及其生化特性［J］.中國(guó)病毒學(xué)，1999，3(14):265-272.

［2］馮 鋒，夏 葦，趙 林，等.我國(guó)一種鸚鵡新病毒的分離［J］.中國(guó)病毒學(xué)，1996，11(4):384-386.

［3］Johne R，Jungmann A，Müller H.Agnoprotein 1a and agroprotein 1b ofavian polyomavirusare apoptotic inducer［J］.J Gen Virol，2000，81(Pt 5):1183-1190.

［4］Johne R，Müller H.Avian polyomavirus agnoprotein 1a is incorporated into the virus particle as a fourth structural protein，VP4［J］.J Gen Virol，2001，82(Pt 4):909-918.

［5］Johne R，Müller H.Nuclear localization of avian polyomavirus structural protein VP1 is a prerequisite for the formation of virus-like particles［J］.J Virol，2004，78(2):930-937.

［6］Ramis A.虎皮鸚鵡同時(shí)暴發(fā)喙羽病病毒和多瘤病毒感染［J］.國(guó)外畜牧科技，1999，26(3):37-40.

［7］蔣文明，莊青葉，馬青霞，等.青島即墨鸚鵡幼雛病的診斷及病毒VP1基因序列分析［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2008，25(12):47-48.

［8］Li J.Molecular analysis of late gene expression and characterization in BFDV (budgerigarfledglingdisease virus)［D］.Giessen:Justus-liebig-Universitat Giessen，1996.

［9］Shen P S，Enderlein D，Nelson C D，et al.The structure of avian polyomavirus reveals variably sized capsids，nonconserved inter-capsomere interactions，and a possible location of the minor capsid protein VP4［J］.Virology，2011，411(1):142-152.

［10］Li J，Liu Q，Müller H，et al.Avian polyomavirus expression patterns of bicistronic late mRNAs［J］.Virology，2009，388(1):42-48.

［11］奧斯伯，金斯頓，塞德?tīng)?，?精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南［M］.4版.北京:科學(xué)出版社，2005.

［12］侯云德.分子病毒學(xué)［M］.北京:學(xué)苑出版社，1990.

［13］李 彤，王恩多.真核生物蛋白質(zhì)翻譯的內(nèi)部起始機(jī)制［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1995，22(6):494-498.

［14］Liu Q.Molecular analysis of late gene expression and characterization of agnoproteins of avian polyomavirus BFDV［D］.Giessen:Justus-liebig-Universitat Giessen，1997.