劉慶華，馬云飛，羅小靜，張 婷

(中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物研究所，武漢430074)

全球每年約有1700萬(wàn)人死于心血管疾病，因急性心肌梗死和慢性心功能不全而導(dǎo)致的死亡占心血管病死亡率50%以上.

20世紀(jì)90年代以來(lái)，胚胎干細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，給心血管疾病的治療帶來(lái)了突破性的進(jìn)展，在某些特殊條件下，胚胎干細(xì)胞可分化為心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，恢復(fù)血流灌注，對(duì)心肌缺血和肢體缺血的治療具有十分重要的意義.但是胚胎干細(xì)胞在體外自然分化為心肌細(xì)胞的效率很低，如何進(jìn)一步提高胚胎干細(xì)胞源心肌細(xì)胞的分化率以確保充足的心肌細(xì)胞來(lái)源是目前亟需解決的首要問(wèn)題.

中藥具有數(shù)千年臨床應(yīng)用的歷史，具有廣泛的藥理作用，包括保護(hù)缺血心肌，減少再灌注損傷，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫，抗免疫排斥，抗細(xì)胞凋亡，促進(jìn)蛋白的表達(dá)等.與細(xì)胞因子和化學(xué)誘導(dǎo)劑相比較而言，中藥更具有廉價(jià)、安全和長(zhǎng)效性的特點(diǎn)，本文綜述了近年來(lái)中藥誘導(dǎo)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化和調(diào)控的研究進(jìn)展，并探討了胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞定向分化所亟需解決的關(guān)鍵問(wèn)題.

1 胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的研究

ES細(xì)胞先是由干細(xì)胞分化為中胚層，再分化為心肌前體細(xì)胞，最終形成心肌終末細(xì)胞(圖1).研究者們嘗試通過(guò)基因重組和轉(zhuǎn)染或各種誘導(dǎo)因子，如TGF-β［1］，BMP，F(xiàn)GF，Wnt［2］和干細(xì)胞生長(zhǎng)因子，維甲酸，維生素C，5-氮胞苷［3］等誘導(dǎo)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，但在干細(xì)胞分化不同時(shí)間點(diǎn)加入誘導(dǎo)劑，產(chǎn)生的效應(yīng)不盡相同，說(shuō)明分化過(guò)程中細(xì)胞因子的時(shí)程表達(dá)對(duì)細(xì)胞分化方向起著決定性作用，在優(yōu)化的時(shí)間點(diǎn)采用細(xì)胞因子組合促進(jìn)ES細(xì)胞的心肌分化被證明較單一因子更為有效.

圖1 胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的過(guò)程圖Fig.1 The process diagram of embryonic stem cells differentiation into myocardial cells

2 中藥誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞的研究

2.1 黃芩苷

黃芩苷(baicalin)是從植物黃芩根中提取出來(lái)的一種黃酮類化合物對(duì)心血管系統(tǒng)有保護(hù)作用，可減小心肌缺血再灌注時(shí)的心肌梗死區(qū)域，移植心肌細(xì)胞的凋亡，保護(hù)心肌缺血再灌注引起的損傷［4，5］.唐美林等［6］發(fā)現(xiàn)黃芩苷能抑制ES細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞之間聯(lián)系更加密切，促進(jìn)ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，同時(shí)黃芩苷通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)促進(jìn)晚期心肌細(xì)胞的分化，特別是工作肌細(xì)胞的產(chǎn)生，說(shuō)明黃芩苷可作為促進(jìn)心肌細(xì)胞分化的誘導(dǎo)劑和心肌細(xì)胞移植治療中的細(xì)胞保護(hù)劑.

2.2 葛根素

葛根素由葛根提取而成，有保護(hù)心肌，抗心律失常，降低血壓和腦血管阻力，抗氧化和雌激素樣作用［7］等.臨床普遍用于治療冠心病、心絞痛、心肌梗死、心率失常和高血壓等疾病.程穎等［8］發(fā)現(xiàn)葛根素能通過(guò)PI3K/Akt通路影響EB大小，進(jìn)而影響ES細(xì)胞的分化方向，促進(jìn)心肌細(xì)胞的分化，提高心室樣心肌細(xì)胞的分化率，通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β和Wnt信號(hào)途徑促進(jìn)ES細(xì)胞的心肌分化和心室肌特化.

2.3 淫羊藿苷

淫羊藿苷(ICA)能夠影響內(nèi)分泌和心血管系統(tǒng)，具有免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤等多種中藥的生物學(xué)活性［9］.朱丹雁等［10］研究了淫羊藿苷對(duì) ES 細(xì)胞的誘導(dǎo)作用，發(fā)現(xiàn)經(jīng) ICA處理48h，多數(shù) ES細(xì)胞處于G0/G1期，而少數(shù)細(xì)胞處于S期，在ES細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的早期，ICA能提高 ES細(xì)胞中cAMP/cGMP的比值，上調(diào)內(nèi)源性NO含量，增加心肌發(fā)育依賴性基因的表達(dá).丁玲等［11］繼續(xù)研究發(fā)現(xiàn)在分化的第5～8d給予ICA，能最有效地誘導(dǎo)ES細(xì)胞體外分化為心肌細(xì)胞.證實(shí)ICA能在心肌分化信號(hào)源頭上增加ROS相關(guān)酶的表達(dá)，在促心肌分化過(guò)程中，ROS及其介導(dǎo)的p38MAPK信號(hào)通路發(fā)揮重要作用.同時(shí)ICA促進(jìn)ES心肌分化過(guò)程中線粒體形成相關(guān)蛋白過(guò)氧化物酶體增生物激活受體γ共激活子-1α的表達(dá)，提高了心肌特異性蛋白α-輔肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白 T 的表達(dá)［12］.

2.4 黃芪

黃芪具有抗氧化作用，能刺激骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其分泌TNF-α和白細(xì)胞介素，黃芪甲苷，黃芪含藥血清［13］和黃芪注射液能誘導(dǎo)MSCs分化為心肌細(xì)胞，誘導(dǎo)后MSCs表達(dá)心肌特異性蛋白結(jié)蛋白(Desmin)、肌鈣蛋白(cTnI)、心肌特異性基因α-心肌肌球蛋白重鏈(α-MHC)和β-心肌肌球蛋白重鏈(β-MHC)增強(qiáng).

2.5 丹參和丹酚酸B

丹參能夠改善心肌供血情況，具有抑制血小板聚集、抗凝、抗血栓形成，降血脂并延緩冠狀動(dòng)脈硬化發(fā)生等藥理學(xué)作用.丹參聯(lián)合(5-aza)［14］和復(fù)方丹參滴丸含藥血清［15］能誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞.丹參水溶性成分中最主要的活性成分是丹酚酸B(SalB)，具有抗氧化作用，和一些誘導(dǎo)劑相似.SalB能改善心肌梗塞大鼠的心臟功能，并能使心肌基因表達(dá)譜發(fā)生改變.陳嘉等［16］研究發(fā)現(xiàn)用30mg/L SalB的低糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)MSCs 24 h后，能增強(qiáng)NKX2.5和GATA-4mRNA的表達(dá)，誘導(dǎo)后分化的第14 d出現(xiàn)α-actin mRNA的表達(dá).SalB聯(lián)合5-aza對(duì)MSCs進(jìn)行聯(lián)合誘導(dǎo)24 h，能提供心肌特異性蛋白cTnT的表達(dá)，能增強(qiáng)心肌早期分化基因NKX2.5和GATA-4表達(dá)［17］，能明顯增強(qiáng) Desmin和 α-actin mRNA表達(dá)［18］，說(shuō)明丹參和SalB對(duì)MSCs向心肌細(xì)胞分化具有一定誘導(dǎo)和促進(jìn)作用.

2.6 人參皂苷和三七皂苷

人參皂苷(GS)是從人參的根、莖、葉中提取精制而成，具有抗氧化作用，對(duì)缺血心肌有保護(hù)作用.人參皂苷Rg1能通過(guò)刺激心肌局部組織分泌粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)而誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞游走至心肌組織進(jìn)而向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化.三七總皂苷(PNS)是三七提取的活性有效成分.三七皂苷以濃度依賴方式減少 S期細(xì)胞，阻滯細(xì)胞于 G0/G1期［19］，經(jīng) GS/PNS 組，5-aza 組，GS/PNS+5-aza 組誘導(dǎo)后的MSC，心肌樣細(xì)胞的特異性蛋白結(jié)蛋白和肌鈣蛋白陽(yáng)性細(xì)胞增多，心肌細(xì)胞特征性基因α-MHC和 β-MHC 的表達(dá)增強(qiáng)［20，21］.

2.7 雙龍方

中藥復(fù)方雙龍方(主要成分人參皂苷Rb1，丹參酚酸B)，具有益氣養(yǎng)血，活血通脈之功效，并在治療心肌梗塞上有顯著作用.有研究小組利用基因芯片技術(shù)［22］和二維電泳分離技術(shù)［23］檢測(cè)雙龍方誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化過(guò)程中差異表達(dá)的基因和蛋白變化，發(fā)現(xiàn)雙龍方能誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞，其所引起的差異基因變化與5-aza相似.綜上不同中藥的藥理作用和研究進(jìn)展匯總見表1.

表1 不同中藥的藥理作用和研究進(jìn)展Fig.1 Pharmacological effects and the research progresses of different of traditional Chinese medicine(TCM)

3 中藥誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞存在的問(wèn)題及前景

隨著ES細(xì)胞的建系和培養(yǎng)技術(shù)，ES細(xì)胞自我更新和定向分化的調(diào)控機(jī)制方面有了更深入的研究.如何充分利用ES細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞，更清楚地了解心肌分化的機(jī)制，多能干細(xì)胞的臨床應(yīng)用和干細(xì)胞移植仍然面臨許多問(wèn)題需要解決:1)明確誘導(dǎo)心肌分化的信號(hào)調(diào)控機(jī)制，尋找合適的誘導(dǎo)條件使ES細(xì)胞有效地分化為心肌細(xì)胞;2)控制合適的移植心肌細(xì)胞的數(shù)目和遷移定位;3)保證移植后細(xì)胞的存活率和增殖狀態(tài);4)促使移植后的心肌細(xì)胞在電生理上與受體組織協(xié)調(diào)一致，安全長(zhǎng)效的發(fā)揮正常生理作用［24，25］.

對(duì)ES細(xì)胞移植治療心肌梗死而言，若能發(fā)現(xiàn)有效促進(jìn)心肌分化的中藥，將大大提高治療效果，其原因如下:1)選擇臨床運(yùn)用廣泛的中藥，促進(jìn)干細(xì)胞分化為足量健康的心肌細(xì)胞，同時(shí)配合移植治療心臟疾病;2)中藥能為體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞提供良好的培養(yǎng)環(huán)境，利于心肌細(xì)胞生長(zhǎng);3)中藥可直接刺激自體干細(xì)胞本身分泌調(diào)控因子，啟動(dòng)心肌分化程序;4)中藥與其他藥物配合，相互作用，能提高誘導(dǎo)效率，高效微量，毒副作用少.

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