吳燕 王貞 （山東省青島市飼料獸藥檢測站 266071）

?

乳及乳制品中添加皮革水解物的檢測

吳燕 王貞 （山東省青島市飼料獸藥檢測站 266071）

本試驗采用紫外分光光度計法測定生鮮乳L-羥脯氨酸的含量來確定是否添加皮革水解物，在前處理過程中用硫酸溶液代替了傳統(tǒng)中氯化亞錫鹽酸溶液水解樣品。結(jié)果表明，L-羥脯氨酸濃度在0~2.0μg/ml呈良好的線性關(guān)系(r=0.9989)，L-羥脯氨酸的回收率為92.8%~100.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.02%。本方法測定皮革奶中 L-羥脯氨酸的含量可操作強(qiáng)，重復(fù)率好，穩(wěn)定性高，適合乳及乳制品中皮革水解物的測定。

乳及乳制品 皮革水解蛋白 L-羥脯氨酸 紫外分光光度法

乳品摻假已成為困擾我國乳品工業(yè)發(fā)展的一個突出問題，在三聚氰胺成為嚴(yán)打的對象后，一些不法企業(yè)和奶站便將目光鎖定在“皮革水解蛋白”。皮革水解蛋白是利用已經(jīng)廢棄的皮革制品或動物毛發(fā)，水解后制成粉末，因而蛋白含量比較高。由于乳及乳制品中蛋白含量要求較高且相對固定，將皮革水解蛋白粉摻入牛奶或奶粉中，再加一些香精、色素等原料而制得的皮革水解產(chǎn)物可提高乳制品中蛋白質(zhì)的含量，這種奶稱為“皮革奶”。皮革奶會改變生鮮乳的口感及氨基酸的組成，降低生鮮乳中氨基酸的吸收利用率，其中含有重金屬鉻被人體吸收后，積累可導(dǎo)致中毒，關(guān)節(jié)疏松腫大，造成人體重金屬中毒甚至造成嬰兒死亡。2009年，衛(wèi)生部已將皮革水解蛋白公布為《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單(第二批)[1]。

在常規(guī)檢測中，試驗結(jié)果是乳及乳制品中全部蛋白質(zhì)含量，無法顯示乳蛋白的實(shí)際含量。所以，添加在乳及乳制品中更為隱蔽，檢測難度更大。L(-)-羥脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)為膠原蛋白中的特有組分，而牛奶中不含此氨基酸，因此鑒定L(-)－羥脯氨酸就能鑒定皮革水解蛋白，如若樣品中含有L(-)-羥脯氨酸，就可判定添加了動物水解蛋白。

因此，為了加強(qiáng)對乳制品的質(zhì)量安全監(jiān)督，必須建立一種快速,并且靈敏度較高的檢測方法來判斷乳制品中有無摻加動物膠原水解蛋白。紫外分光光度法利用羥脯氨酸難揮發(fā)，在紫外區(qū)有微弱的吸收，沒有熒光基團(tuán)等性質(zhì)進(jìn)行檢測。膠原蛋白在濃酸或濃堿的條件下，經(jīng)過高溫長時間水解，徹底變成游離的氨基酸。其中的羥脯氨酸首先用氯胺 T氧化生成含吡咯環(huán)的物質(zhì)，然后以高氯酸溶液除去剩余的氯胺T，加入對－二甲基氨基苯甲醛溶液作為顯色劑，生成紅色化合物，用紫外可見分光光度計測定558nm處的吸光值，從而得到羥脯氨酸的質(zhì)量濃度[2]。本試驗建立紫外分光光度法測定生鮮乳中皮革水解蛋白的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

DV-800紫外可見分光光度計(貝克曼公司)、高速冷凍離心機(jī)(Heraeus公司)、水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠）、DGG-9240A干燥箱(上海森信實(shí)驗儀器有限公司)。

1.2 試劑

1.2.1 氯胺T溶液 將1.41g氯胺T溶于10ml水中，依次加入10ml正丙醇和80ml緩沖溶液。現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 （1）L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液(500μg/ml)。精密稱取L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(國藥集團(tuán))50mg，用少量0.02mol/l鹽酸溶解并定容至100ml容量瓶。（2）L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液(5μg/ml)：吸取L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液5.00ml于500ml容量瓶中，定容。

1.2.3 緩沖液 將50g檸檬酸，26.3g氫氧化鈉和146.1g無水乙酸鈉(GB694)溶于水，稀釋至1L，此溶液與200ml水和300ml正丙醇混合。

1.2.4 氫氧化鈉溶液 1mol/L、10mol/L

1.2.5 硫酸溶液 C(H2SO4)≈3mol/L量取750ml水于2L的燒杯中,在攪拌下緩慢加入320ml濃硫酸,冷卻至室溫后用水定容至2L。

1.2.6 生鮮乳樣品 青島生鮮乳站。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 稱取5g樣品于100ml錐形瓶中，加入3mol/L硫酸溶液30ml，用表面皿蓋住，于105℃干燥箱內(nèi)恒溫16h。用濾紙趁熱將水解產(chǎn)物過濾至250ml容量瓶中。用3mol/L硫酸溶液10ml分3次洗滌燒瓶和濾紙，合并至容量瓶中。用水定容，搖勻。用移液管吸取25ml該溶液至250ml容量瓶中用水定容。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別吸取L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液10ml、20ml、30ml、40ml于100ml容量瓶中，定容。所得的標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度分別是0.5、1.0、1.5、2.0μg/ml。取上述不同濃度的溶液5ml于10ml比色管中，加入2ml氯胺T溶液，混勻后于室溫下放置20min。再加入2ml顯色劑于比色管中，充分混合，將比色管蓋上蓋迅速放入60℃水浴中，加熱20min。取出比色管，用流動水冷卻，在室溫下放置30min。濃度分別是0.28、0.56、0.83、1.11μg/ml。用紫外分光光度計在558nm波長處測定吸光度，同法用水制備空白。以吸光度為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 樣品的測定 吸取已制備好的樣品液5ml于比色管中，按照1.2.2中的方法進(jìn)行操作，在558nm波長處測定吸光度。從所得標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得其中L-羥脯氨酸的濃度。L-羥脯氨酸的含量計算：

式中：X—樣品中L(-)-羥脯氨酸的含量(μg/g)；C—從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的L(-)-羥脯氨酸量(μg/ml)；m—稱取試樣的質(zhì)量(g)；V1—樣液體積(ml)；A—稀釋倍數(shù)。

1.2.4 加標(biāo)回收率 取6支比色管，每管中均加入5ml牛奶，分別加入適量的L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，按1.2.1方法處理樣品，測定其吸光度，計算加標(biāo)回收率。

1.2.5 精密度試驗 取3個樣品，按樣品測定方法重復(fù)測定6次，測其精密度。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在波長558nm處測定吸光值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)，得到線性回歸方程為：y=0.2532x+0.0018，r=0.9989。由圖1可知吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系，線性范圍是0~ 2.0μg/ml。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程制備

圖1 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 加標(biāo)回收率

按樣品測定方法測定回收率結(jié)果見表2，由表2可以看出其加標(biāo)回收率在92.8%~100.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.02%，本試驗準(zhǔn)確度是符合分光光度計的實(shí)驗要求的。

表2 L-羥脯氨酸回收率 (μg/ml、%)

2.3 精密度試驗

3個試樣分別重復(fù)做5次做精密度實(shí)驗檢測結(jié)果見表3，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.81%~1.46%，符合試驗精密度的實(shí)驗要求。

表3 精密度試驗

3 結(jié)論與討論

目前的國家標(biāo)準(zhǔn)中還沒有乳及乳制品中L(-)-羥脯氨酸的檢測標(biāo)準(zhǔn)，大部分的檢測方法引用的是已經(jīng)作廢的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 9695·23-1990《肉與肉制品L(-)-羥脯氨酸含量測定》(簡稱90版)。此方法與90版區(qū)別是樣品的前處理方法，是用硫酸溶液代替氯化亞錫的鹽酸溶液。因為鹽酸易揮發(fā)，水解過程中必須水浴加熱16h，用冷凝裝置再回流。用硫酸水解不易揮發(fā)，只用普通燒杯即可，操作簡單可行。

本試驗測定乳或乳制品中羥脯氨酸，其回收率在92.8%~100.8%之間,精密度試驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.81%~ 1.46%，檢測條件穩(wěn)定，加標(biāo)回收率高，變異系數(shù)較小，其準(zhǔn)確度和精密度均較好，儀器要求低，應(yīng)用簡單方便，所以此方法可以檢查乳或乳制品中是否含有L-羥脯氨酸，對生鮮乳中皮革水解蛋白鑒定標(biāo)準(zhǔn)的制定提供可靠的實(shí)驗室數(shù)據(jù)及科學(xué)依據(jù)。

[1] 黃文水, 吳麗萍. “皮革奶”中L-羥脯氨酸的測定[J]. 光譜實(shí)驗室. 2011, 28(6): 3094-3096.

[2] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗和檢疫總局和中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會國家標(biāo)準(zhǔn). GB/T 9695.23-2008. 肉與肉制品羥脯氨酸含量測定[s]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008.

（2012–12–20）

S859.84

A

1007-1733(2013)01-0027-02