王金勝 龔 雁 羅亞娟 繆曉青 方文富

（福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福州 350002）

四氯化碳（CCl4）是一種工業(yè)溶劑，廣泛用于誘導(dǎo)化學(xué)性肝損傷。CCl4主要是通過(guò)肝微粒體細(xì)胞色素P450作用形成三氯甲基自由基，它能與巰基（谷胱甘肽和蛋白質(zhì)硫醇）和抗氧化酶如過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶結(jié)合。三氯甲基自由基產(chǎn)生過(guò)量就會(huì)引起膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，最終導(dǎo)致了各種肝疾病病理過(guò)程，如脂肪肝，纖維化和肝硬化[1]。因此，尋找天然有效、無(wú)毒副作用的藥物來(lái)治療肝損傷及其并發(fā)癥至關(guān)重要。

蜂王漿是由工蜂頭部的上顎腺分泌的粘稠的漿狀物，它是蜂王唯一的食物，也是工蜂和雄蜂3日齡以內(nèi)小幼蟲(chóng)的食物，在蜜蜂的生長(zhǎng)發(fā)育上起著重要的影響作用。它對(duì)肝臟疾病具有很好的療效[2]，它可以增強(qiáng)免疫功能、抗菌抗病毒、促進(jìn)肝組織再生、抑制貯脂細(xì)胞活化、氨基酸等成分的作用、均衡營(yíng)養(yǎng)和調(diào)節(jié)代謝作用等，它可以標(biāo)本兼治，而且無(wú)毒副作用[3]。本研究的目的就是來(lái)探討蜂王漿對(duì)CCl4引起小鼠急性肝損傷保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：

健康的雄性小鼠（mus musculus），體重18～22 g，由上海斯萊特林實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料：

新鮮的蜂王漿，2012年福建省莆田市江口龍眼花期生產(chǎn)，由福州市蜜蜂協(xié)會(huì)意蜂實(shí)驗(yàn)場(chǎng)提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑：

聯(lián)苯雙酯滴丸，由浙江萬(wàn)邦藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；四氯化碳為分析純，由開(kāi)封化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；AST、ALT酶聯(lián)免疫試劑盒、MDA、GSH-Px試劑盒，由南京建成生物研究所提供；

1.1.4 主要儀器：酶標(biāo)儀；分光光度計(jì)；恒溫箱

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肝損傷模型的建立和分組

健康的雄性小鼠，體重18～22 g，在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)一周，自由進(jìn)食進(jìn)水。小鼠隨機(jī)分成6組：正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、蜂王漿高、中、低劑量組。按照國(guó)內(nèi)常用的方法[4]進(jìn)行造模：腹腔注射0.1%（v/v）CCl4玉米油溶液10 ml/kg，禁食，不禁水。

1.2.2 給藥及動(dòng)物處理

造模18 h后開(kāi)始灌胃給藥，每天灌胃一次，連續(xù)28 d。正常對(duì)照組和模型組給予生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組給予聯(lián)苯雙酯（150 mg/kg），蜂王漿高、中、低劑量組濃度分別為：0.8 g/kg、1.6 g/kg、3.2 g/kg。均自由進(jìn)食。

于末次給藥后2 h，除空白對(duì)照組外分別進(jìn)行腹腔注射CCl4玉米油溶液，空白對(duì)照組腹腔注射同劑量的玉米油，禁食不禁水，18 h后經(jīng)摘取眼球取血，并脫頸椎處死。

1.2.3 血清中AST、ALT測(cè)定

收集的血樣以4000 rpm離心10 min，取血清，采用雙抗體夾心法按照試劑盒的說(shuō)明來(lái)測(cè)定血清中AST、ALT含量。

1.2.4 肝臟中MDA和GSH-Px的測(cè)定

剪取0.5 g肝臟置于碾磨器中，加入5 ml生理鹽水進(jìn)行充分碾磨，4500 rpm離心10 min，取上清液，制成10%的勻漿。按照試劑盒的說(shuō)明測(cè)定肝組織中MDA的含量和GSH含量。組織中蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

組間比較用one-way ANOVA。方差齊性時(shí)，采用LSD方法進(jìn)行組間多重比較；方差不齊時(shí)，采用DunnettT 3方法進(jìn)行組間多重比較。用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示，P<0.05定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂王漿對(duì)CCl4引起的急性肝損傷小鼠血清中AST和ALT含量的影響

蜂王漿對(duì)CCl4引起的急性肝損傷小鼠血清中AST和ALT影響的實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：模型組的AST和ALT含量分別極顯著高于正常對(duì)照組的（P<0.01），表明本實(shí)驗(yàn)小鼠急性肝損傷造模成功；飼喂高、中、低三個(gè)劑量蜂王漿組、正常對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組血清中的AST、ALT含量之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但它們都極顯著低于模型組的（P<0.01），說(shuō)明說(shuō)明飼喂一定劑量的蜂王漿對(duì)小鼠抗肝細(xì)胞受損和抗肝細(xì)胞壞死具有極顯著作用（表1和表2）。

表1 蜂王漿對(duì)CCl4肝損傷小鼠血清中AST含量影響的實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果（x± s ）

表2 蜂王漿對(duì)CCl4肝損傷小鼠血清中ALT含量影響的實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果（x± s ）

2.2 蜂王漿對(duì)CCl4引起急性肝損傷小鼠肝勻漿中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量的影響

蜂王漿對(duì)CCl4引起急性肝損傷小鼠肝勻漿中MDA含量影響的實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果：模型組MDA的含量極顯著高于正常對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組的（P<0.01），說(shuō)明模型組小鼠肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化程度嚴(yán)重；正常對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、蜂王漿低劑量組、蜂王漿中劑量組和蜂王漿高劑量組的MDA含量之間無(wú)顯著差異（P>0.05），但它們都極顯著低于模型組的（P<0.01），說(shuō)明飼喂一定劑量的蜂王漿對(duì)小鼠抗肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化具有極顯著作用（表3）。

表3 蜂王漿對(duì)CCl4肝損傷小鼠肝臟中MDA含量影響的實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果（±s ）

表3 蜂王漿對(duì)CCl4肝損傷小鼠肝臟中MDA含量影響的實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果（±s ）

注：1）小寫(xiě)字母表示差異達(dá)顯著水平（P<0.05）。大寫(xiě)字母表示差異達(dá)極顯著水平（P<0.01）

處理 n MDA[nmol·（mgpr）-1 ]模型組 10 6.2398±1.4754 aA1 ）蜂王漿低劑量組（0.8 g/kg） 10 3.7169±0.3959 bB陽(yáng)性對(duì)照組（0.15 g/kg） 10 3.4274±0.1319 bB蜂王漿中劑量組（1.6 g/kg） 10 3.2614±0.2356 bB正常對(duì)照組 10 3.1743±0.1996 bB蜂王漿高劑量組（3.2 g/kg） 10 2.8608±0.1196 bB

2.3 蜂王漿對(duì)CCl4引起急性肝損傷小鼠肝勻漿中GSH-Px含量的影響

蜂王漿對(duì)CCl4引起急性肝損傷小鼠肝勻漿中GSH-Px含量影響的實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果：正常對(duì)照組、蜂王漿低劑量組、蜂王漿中劑量組和蜂王漿高劑量組的GSH-Px含量之間無(wú)顯著差異（P>0.05），但它們極顯著高于模型組的（P<0.01），且極顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組的（P<0.01），說(shuō)明飼喂一定劑量的蜂王漿對(duì)小鼠肝臟細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能完整性能起到極顯著的保護(hù)作用，但其保護(hù)作用極顯著不如采用聯(lián)苯雙酯的（表4）。

表4 蜂王漿對(duì)CCl4肝損傷小鼠肝臟中GSH-Px含量影響的實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果（x± s ）

3 討論

（1）CCl4引起的肝損傷是篩選保肝藥物而廣泛使用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀１狙芯拷Y(jié)果顯示：模型組的AST和ALT含量分別極顯著高于正常對(duì)照組的（P<0.01），表明本實(shí)驗(yàn)小鼠急性肝損傷造模成功；飼喂高、中、低三個(gè)劑量蜂王漿組和正常對(duì)照組血清中的AST和ALT含量之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但它們都極顯著低于模型組的（P<0.01）。

模型組中AST和ALT含量高于正常對(duì)照組的，主要是由于CCl4作用于肝臟細(xì)胞，破壞細(xì)胞膜，細(xì)胞中的AST和ALT釋放出來(lái)造成的。

正常對(duì)照組、蜂王漿三個(gè)劑量組的AST和ALT含量之間無(wú)顯著性差異，這主要是由于飼喂一定劑量的蜂王漿對(duì)小鼠的肝細(xì)胞具有保護(hù)作用，但具有保護(hù)作用的適當(dāng)劑量尚需進(jìn)一步研究確定。

蜂王漿三個(gè)劑量組的AST和ALT含量極顯著低于模型組的，這可能是由于蜂王漿中一些抗氧化成分例如蛋白質(zhì)[5]、抗氧化酶等減輕了CCl4對(duì)肝臟的作用。

上述結(jié)果表明蜂王漿對(duì)CCl4引起的急性肝損傷起到了一定的修復(fù)作用。

（2）有報(bào)道四氯化碳是毒性代謝物，經(jīng)過(guò)細(xì)胞色素P450的作用，生成具有高活性的三氯甲基自由基（·CCl3），會(huì)嚴(yán)重的損害肝細(xì)胞[6]?！Cl3通過(guò)肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的NADH-依賴細(xì)胞色素P450進(jìn)行轉(zhuǎn)換，能夠攻擊多元不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過(guò)氧化。脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)是產(chǎn)生細(xì)胞損傷的一個(gè)重要生物氧化過(guò)程。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化形成的最終產(chǎn)物，MDA水平的測(cè)定也是評(píng)價(jià)脂質(zhì)過(guò)氧化最常用的方法。

本研究結(jié)果顯示：模型組MDA的含量極顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01），這主要是由于模型組小鼠肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化程度嚴(yán)重造成的；正常對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、蜂王漿各劑量組的MDA含量之間無(wú)顯著差異（P＞0.05），但它們都極顯著低于模型組的（P<0.01），這可能是由于蜂王漿中含有豐富的抗氧化成分，減輕了自由基對(duì)肝臟中不飽和脂肪酸的損害所致。

（3）GSH-Px是一種重要的催化過(guò)氧化氫（H2O2）分解的酶，它特異性催化GSH對(duì)過(guò)氧化氫的還原反應(yīng)，從而對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能完整性起到保護(hù)作用。GSH-Px也能催化氧化型谷胱甘肽（GSSH）轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型谷胱甘肽（GSH），加速體內(nèi)毒性自由基的清除，從而減輕自由基對(duì)生物膜中不飽和脂肪酸的攻擊，有效地減少肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，增強(qiáng)肝細(xì)胞對(duì)自由基的抵抗力[7]。

本研究結(jié)果顯示：模型組GSH-Px的含量極顯著低于正常對(duì)照組（P<0.01）；正常對(duì)照組、蜂王漿各劑量組的GSH-Px含量之間無(wú)顯著差異（P>0.05），但極顯著高于模型組的（P<0.01），這可能是由于蜂王漿中豐富抗氧化物質(zhì)例如Cu/Zn-SOD[8]的作用，同時(shí)增強(qiáng)了機(jī)體清除自由基的能力，從而減輕自由基對(duì)膜上不飽和脂肪酸的損害所致。

蜂王漿各劑量組的GSH-Px含量極顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組的（P<0.01），這主要是由于蜂王漿畢竟不是藥物其對(duì)肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能完整性的保護(hù)作用遠(yuǎn)不及采用聯(lián)苯雙酯的緣故。

綜上所述，蜂王漿可以顯著改善轉(zhuǎn)氨酶的水平，減輕肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化程度，對(duì)肝損傷具有顯著的保護(hù)作用。

[1]方士英，姚宏偉，李俊，等.蟲(chóng)草多糖對(duì)小鼠化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，39（3）：201-204.

[2]郭芳彬.蜂王漿與肝臟病[J].養(yǎng)蜂科技，2002，27（5）：27-31.

[3]蘇曄等.蜂王漿化學(xué)成分、生理活性及應(yīng)用[J].蜜蜂雜志，2000（9）：23-24

[4]唐云安，劉玉清，王國(guó)欽.肝損傷動(dòng)物模型研究進(jìn)展[J].衛(wèi)生毒理學(xué)雜志，2002，16（4）：236-238.

[5]Takeshi Nagai，Reiji inoue.preparation and the functional properties of water extract and alkaline extract of royal jelly[J].Food chemistry，2004（84）：181-186.

[6]Tomas，A.，Albano，E.，Banni，S.，Botti，B.，Corongiu，F(xiàn).，Dessi，M.A.，Iannone，A.，Vannini，V.，Dianzani M.U.，1987.Free-radical metabolism of carbon tetrachloride in rat liver mitochondria.A study of the mechanism of activation.Biochem.J.246，313-317.

[7]Galle PR，Hofmann WJ，Walczak H，et al.Involvement of the CD95（APO21/Fas）receptor and ligand in liver damage.J Exp Med，1995；182：1223-1230.

[8]閔麗娥，李佳等，等.意蜂蜂王漿超氧化物歧化酶的分離純化及部分性質(zhì)[J].昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2004，47（2）：171-177.