曹 蘭 戴榮國(guó) 王瑞生 任 勤 程 尚 沈克飛 姬聰慧 羅文華

（重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460）

中蜂囊狀幼蟲(chóng)病是對(duì)中蜂養(yǎng)殖危害極其嚴(yán)重的病毒性疾病，傳染性極強(qiáng)。該病病原為中華蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病病毒，是單股正鏈小RNA樣病毒。該病主要采取綜合防治措施防控，如：換王斷子、嚴(yán)格消毒、加強(qiáng)管理，使用抗病毒藥物配以抗生素預(yù)防繼發(fā)感染。目前，該病由于缺乏安全高效的抗病毒藥物，生產(chǎn)中存在濫用藥物現(xiàn)象，這使我國(guó)當(dāng)前蜂產(chǎn)品藥物殘留較高，蜂產(chǎn)品出口受限。因而，研發(fā)高效、安全、無(wú)殘留的蜂藥是當(dāng)今養(yǎng)蜂業(yè)的迫切需求。

牛乳鐵蛋白肽是由牛乳鐵蛋白經(jīng)蛋白酶消化后釋放的一系列多功能天然活性肽，其中LfcinB具有廣泛的生物學(xué)活性，具有廣譜殺菌、抗病毒、消炎、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)等作用。據(jù)研究[1]，LfcinB可以抑制HIV、細(xì)胞巨化病毒、皰疹1型病毒、肝炎病毒和流感病毒等。McCann（2003）研究揭示蛋白肽可能通過(guò)作用于易感細(xì)胞表面干擾病毒與細(xì)胞表面受體的相互作用，阻止病毒吸附和進(jìn)入細(xì)胞，如LfcinB和人乳鐵蛋白肽LfcinH的抗皰疹病毒感染就是通過(guò)直接與宿主細(xì)胞表面的硫化肝素或粘多糖結(jié)合，阻止HSV病毒與細(xì)胞表面HS和粘多糖結(jié)合，達(dá)到抑制HSV感染的目的。本試驗(yàn)主要是觀察LfcinB（4-9）抗中蜂囊狀幼蟲(chóng)病的作用效果。

1 材料與方法

1.1 蜂群

要求蜂群健康無(wú)病，各蜂群的群勢(shì)基本一致，平均為4足框，配置基本飼養(yǎng)蜂具。

1.2 LfcinB（4-9）

由L型氨基酸組成，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成制備，高效液相色譜純度大于99%。

1.3 中蜂囊狀幼蟲(chóng)病病毒

采集具有典型中蜂囊狀幼蟲(chóng)病癥狀的染病病蟲(chóng)，用RT-PCR檢測(cè)中蜂囊狀幼蟲(chóng)病病毒顯陽(yáng)性[2]。

1.4 幼蟲(chóng)死亡率檢測(cè)耗材

30×50cm透明薄膜、記號(hào)筆、照相機(jī)等。

試驗(yàn)分成5組，每個(gè)試驗(yàn)組3群蜂，共計(jì)15群。

1.5 病毒制備

將1 g感染中蜂囊狀幼蟲(chóng)病的蜂幼蟲(chóng)放在研磨器中研磨10 min，混懸液經(jīng)12 000 r/m離心10 min，吸取上清。上清經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，加入1000 ml糖水中，即為病毒種子液。

1.6 病毒接種

將病毒種子液在傍晚時(shí)分噴灑于試驗(yàn)蜂群中，每脾雙面噴，最后噴巢門，連續(xù)噴灑病毒液3天，待檢查發(fā)病后用于實(shí)驗(yàn)。

1.7 分組與給藥

將蜂群分為5組，見(jiàn)表1。以上試驗(yàn)組傍晚飼喂糖漿（白砂糖：水=1：1.2），每次每足脾飼喂50 ml糖漿，隔日飼喂一次，連續(xù)9天。每9天測(cè)定幼蟲(chóng)死亡率。

表1 試驗(yàn)分組

1.8 幼蟲(chóng)死亡率測(cè)定方法

開(kāi)箱后先將子脾蜜蜂抖落在蜂箱中，用蜂掃掃掉殘留在脾上的蜂，然后將脾平放在瓷盤中，用30×50cm的薄膜貼在脾上做好定位標(biāo)記，在薄膜上標(biāo)記未封蓋的100只幼蟲(chóng)或卵巢房，計(jì)數(shù)為標(biāo)記幼蟲(chóng)或卵A只。9天后用標(biāo)記的薄膜貼在原來(lái)的仔脾上，對(duì)準(zhǔn)位置，查看紅色標(biāo)記的巢房是否封蓋，若未封蓋，在薄膜上標(biāo)記并計(jì)算未封蓋或者穿孔的封蓋子數(shù)，計(jì)數(shù)為未封蓋幼蟲(chóng)或卵B只。未封蓋的幼蟲(chóng)或穿孔封蓋子一旦發(fā)病，必將死亡即假定認(rèn)為該幼蟲(chóng)發(fā)病死亡，該群幼蟲(chóng)的發(fā)病率即為該群的幼蟲(chóng)死亡率。同時(shí)，做好下一次的幼蟲(chóng)或卵標(biāo)記，重復(fù)上述試驗(yàn)。

幼蟲(chóng)死亡率=B/A×100%[3]

1.9 病情指數(shù)計(jì)算方法[3]

按幼蟲(chóng)發(fā)病死亡輕重程度分級(jí)。0級(jí)：子脾上未發(fā)現(xiàn)病蟲(chóng)；1級(jí)：病死蟲(chóng)數(shù)占總幼蟲(chóng)數(shù)小于5%；2級(jí)：病死蟲(chóng)數(shù)占總幼蟲(chóng)數(shù)的5%～30%；3級(jí)：病死蟲(chóng)數(shù)占總幼蟲(chóng)數(shù)大于30%。病情指數(shù)越大，說(shuō)明病害越嚴(yán)重。

1.1 0 防治效果[3]

利用各處理組蜂群的幼蟲(chóng)死亡率，計(jì)算LfcinB（4-9）對(duì)蜂群的防治效果。

2 結(jié)果

2.1 LfcinB（4-9）對(duì)中蜂囊狀幼蟲(chóng)病幼蟲(chóng)死亡率的影響

試驗(yàn)蜂群攻毒后，測(cè)定蜂群用肽前、用肽后第9天和第18天的幼蟲(chóng)死亡率，見(jiàn)表2。給藥后第9天和第18天，相對(duì)于攻毒未給藥的第4組，第1、第2、第3給藥組幼蟲(chóng)死亡率明顯降低。給藥后第9天，第2組和第3組較第4組差異顯著，幼蟲(chóng)死亡率分別降到18.67%和19.00%，第四組幼蟲(chóng)死亡率升高為46.50%；給藥后第18天，第1組和第2組較第4組差異顯著，幼蟲(chóng)死亡率分別為23.46%和19.63%，第3組與第4組差異極顯著，幼蟲(chóng)死亡率為17.08%，第4組幼蟲(chóng)死亡率37.25%。

表2 牛乳鐵蛋白肽對(duì)中蜂囊狀幼蟲(chóng)病幼蟲(chóng)死亡率的影響

2.2 LfcinB（4-9）對(duì)蜂群病情指數(shù)的影響

試驗(yàn)開(kāi)始前后跟蹤測(cè)定每群幼蟲(chóng)死亡率多次，即給肽前（第一次、第二次）、給肽后（第三次、第四次）和停肽后（第五次、第六次）。飼喂LfcinB（4-9）17天以后，中蜂囊狀幼蟲(chóng)病幼蟲(chóng)死亡率的病情指數(shù)呈下降趨勢(shì)，第3組的病情指數(shù)較其它兩組的低。三組病情指數(shù)均在66.7%以上，低于發(fā)病沒(méi)用肽的第4組，高于沒(méi)發(fā)病沒(méi)用肽的第5組。

圖1 LfcinB（4-9）對(duì)試驗(yàn)蜂群病情指數(shù)情況圖

2.3 LfcinB（4-9）對(duì)中蜂囊狀幼蟲(chóng)病的防治效果

LfcinB（4-9）對(duì)中蜂囊狀幼蟲(chóng)病在短期（9天）內(nèi)防治作用不明顯，最高防治效果為第2組59.85%，最低防治效果為第一組50.54%，第三組為59.14%。長(zhǎng)時(shí)間（18天后），LfcinB（4-9）對(duì)中蜂囊狀幼蟲(chóng)病防治作用較突出，其中第三組的防治效果最好為72.02%，最低為第一組40.32%，第二組為55.14%。此結(jié)果表明低濃度（第三組）的LfcinB（4-9）對(duì)中蜂囊狀幼蟲(chóng)病的防治效果較好。

3 討論

由本次試驗(yàn)可以看出，飼喂LfcinB（4-9）后，受試蜂群病情有所好轉(zhuǎn)，低濃度2.83mg/1000ml的Lf cin B（4-9）的糖漿治療效果較高濃度的LfcinB（4-9）較好。至于2.83mg/1000ml的LfcinB（4-9）糖漿是不是最佳防治該病的濃度，還需進(jìn)一步研究。另外，在短時(shí)間（9天左右）情況下LfcinB（4-9）對(duì)中蜂囊狀幼蟲(chóng)的防治效果不明顯，最高為59.85%，長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)（18天左右），LfcinB（4-9）對(duì)中蜂囊狀幼蟲(chóng)病的防治效果最高為72.02%，對(duì)蜂群病毒病來(lái)說(shuō)有輕微治療效果。在第二年繁蜂季節(jié)，筆者發(fā)現(xiàn)凡飼喂了LfcinB（4-9）的蜂群均未發(fā)幼蟲(chóng)病，而未飼喂LfcinB（4-9）的陽(yáng)性對(duì)照組仍可見(jiàn)嚴(yán)重的中蜂囊狀幼蟲(chóng)病。筆者認(rèn)為蜂群感染病毒發(fā)病后，在幼蟲(chóng)期任何一種藥物可能都無(wú)法挽回感染蜂群?jiǎn)蝹€(gè)個(gè)體的幼蟲(chóng)生命，因?yàn)檎５挠紫x(chóng)歷經(jīng)5天后即成封蓋子蜂蛹，處于幼蟲(chóng)期的5天時(shí)間，要想使用藥物阻斷病毒繁殖感染其它幼蟲(chóng)或者殺滅幼蟲(chóng)體內(nèi)病毒，是非常困難的。本試驗(yàn)對(duì)發(fā)病蜂群施肽的目的在于防止新孵出的健康幼蟲(chóng)被帶毒病死蟲(chóng)感染，所以使用LfcinB（4-9）防治中蜂囊狀幼蟲(chóng)病需要過(guò)程和時(shí)間，其效果更多在于蜂群施肽后期的抗病力表現(xiàn)。

表3 LfcinB（4-9）對(duì)中蜂囊狀幼蟲(chóng)病的防治效果

對(duì)于LfcinB（4-9）對(duì)中蜂囊狀幼蟲(chóng)病的防治作用，筆者設(shè)想其作用機(jī)理。在發(fā)病蜂群內(nèi)，病死幼蟲(chóng)感染新孵出的健康幼蟲(chóng)，主要傳播者是成年蜂，因?yàn)槌赡攴潴w內(nèi)也帶毒，使用牛乳鐵蛋白肽飼喂蜂群，首先是成年蜂消化道接觸牛乳鐵蛋白肽，筆者設(shè)想該肽可以修復(fù)或潤(rùn)滑通暢成年蜂體內(nèi)消化道，使其病毒不易在體內(nèi)生存，從而減少新孵出幼蟲(chóng)的感染機(jī)會(huì)。

[1]陳歷俊，姜鐵民.乳鐵蛋白生物功能及基因表達(dá)[M].北京：科學(xué)出版社，2007.

[2]曹蘭，張邑帆，戴榮國(guó)，等.用RT-PCR方法鑒定中蜂囊狀幼蟲(chóng)病病毒.中國(guó)蜂業(yè)，2011，62（7-9）：33-35.

[3]王建鼎，梁勤，蘇榮.蜜蜂保護(hù)學(xué)[M].中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1997.