李紅艷，曹 陽，白雪媛，趙 丹，張曉丹，楊靜嫻，康廷國

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧 大連 116600；2.遼寧省大連市華信理化檢測中心有限公司檢測部， 遼寧 大連 116600；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，吉林 長春 130117)

楊靜嫻(Tel：0411-87586009，E-mail：jingxianyang@yahoo.com)

人參蛋白對β淀粉樣蛋白140和H2O2損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制

李紅艷1，曹 陽2，白雪媛3，趙 丹1，張曉丹1，楊靜嫻1，康廷國1

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧 大連 116600；2.遼寧省大連市華信理化檢測中心有限公司檢測部， 遼寧 大連 116600；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，吉林 長春 130117)

目的：探討人參蛋白(GP)對β淀粉樣蛋白1-40(Aβ1-40)和過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的影響，闡明GP對神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法：從新生乳鼠大腦皮層中分離純化神經(jīng)元，培養(yǎng)12 d后，分別采用Aβ1-40(30 μmol·L-1)和H2O2(200 μmol·L-1)誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷，并隨機(jī)分為模型組(Aβ1-40模型組與H2O2模型組，不加藥物)、GP組和GP含藥血清組。采用MTT法檢測各組神經(jīng)元存活率；試劑盒法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中一氧化氮合酶(NOS)活性和一氧化氮(NO)水平；Hoechst 33342/PI熒光染色檢測細(xì)胞凋亡與壞死率。結(jié)果：倒置熒光顯微鏡，Aβ1-40和H2O2處理后，神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，軸突縮短或消失，胞體變圓、縮小，大小不等，核固縮，核染色質(zhì)聚集；Heochst 33342染色呈現(xiàn)高藍(lán)光；部分細(xì)胞PI染色呈現(xiàn)高紅光。加入GP及其含藥血清后，神經(jīng)元數(shù)量增多，胞體增大，細(xì)胞核著色形態(tài)為圓形、淡藍(lán)色，PI陽性細(xì)胞數(shù)量減少。MTT法，GP組細(xì)胞存活率明顯高于模型組(Plt;0.05或Plt;0.01)，GP含藥血清組與模型組無顯著差異(5%GP含藥血清組除外，Pgt;0.05)；試劑盒法，GP組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NOS活性與NO水平明顯低于模型組(Plt;0.05 或Plt;0.01)；Hoechst 33342/PI法，GP及其含藥血清組細(xì)胞凋亡率低于模型組，以GP組差異更明顯(Plt;0.05或Plt;0.01)，GP及其含藥血清組細(xì)胞壞死率與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。結(jié)論：GP具有神經(jīng)保護(hù)作用，作用機(jī)制與減少NOS活性、降低NO水平、抑制神經(jīng)元凋亡有關(guān)。

人參蛋白；血清；神經(jīng)元；β淀粉樣蛋白；細(xì)胞凋亡

人參系五加科植物人參(PanaxginsengC.A.Meyer.)的干燥根及根莖，具有安神益智等功效[1]。目前已有關(guān)于人參促智作用的研究，但研究大多以人參皂苷為活性成分[2-4]，人參蛋白(ginseng protein,GP)已被證明具有抗氧化[5-6]、增強(qiáng)免疫等藥理活性[7]，這些活性為GP的抗衰老研究提供了藥理學(xué)基礎(chǔ)。然而，關(guān)于GP的促智作用及其對神經(jīng)細(xì)胞的影響目前尚未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過研究GP對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，為進(jìn)一步研究人參安神益智的物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)，為探討GP抗衰老作用及其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器

出生24 h內(nèi)昆明種小鼠15只，用于制備神經(jīng)元；5月齡昆明種清潔級(jí)小鼠30只(體質(zhì)量25～28 g，雌雄各半)，用于制備含藥血清。小鼠均購自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK遼2008-0002；人參購自吉林省靖宇縣，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室姜大成教授鑒定為五加科植物人參(符合中國藥典2010版規(guī)定)，DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS，美國Gibco公司)，β淀粉樣蛋白1-40(beta-amyloid protein1-40,Aβ1-40)、Hoechst 33342、碘化丙啶(PI)、多聚賴氨酸和Bradford蛋白含量試劑盒(德國Sigma公司)，一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)和一氧化氮(nitric oxide，NO)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，NU-4750型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Nuaire公司)；MR-96A型酶標(biāo)儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，UV-1800型紫外-可見分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司)，DW-86L386型超低溫冰箱(青島海爾電器有限公司)，NIB-100F型倒置熒光顯微鏡(寧波永新光學(xué)有限公司)。

1.2 GP的制備

GP由長春中醫(yī)藥大學(xué)趙雨教授提供，經(jīng)Bradford蛋白濃度測定試劑盒檢測，蛋白濃度為80.6%。具體制備方法為：新鮮人參洗凈、室溫自然干燥，經(jīng)高速組織粉碎機(jī)粉碎，加入10倍量(W/V=g·mL-1)pH7.5 PBS緩沖液，4℃浸提2次，每次12 h，浸提液離心，合并上清。經(jīng)中空纖維膜過濾裝置，采用0.45 μm微濾膜和相對分子量為10 000的超濾膜分別進(jìn)行微濾除雜、超濾除雜及濃縮，收集超濾濃縮液，冷凍干燥即得。

1.3 GP含藥血清制備

30只5月齡昆明小鼠隨機(jī)分為GP高劑量組(1 g·kg-1·d-1)、GP低劑量組(0.5 g·kg-1·d-1)和空白組(給予生理鹽水)，每組10只，各組小鼠以灌胃方式給藥，每日2次，連續(xù)30 d。末次給藥后，各組小鼠眼球取血，4℃、2 000 r·min-1離心10 min，收集上層淺黃色血清，即得GP高、低劑量小鼠含藥血清和空白血清，相同組合并。各留取500 μL，56℃滅活30 min，放涼后無菌過濾分裝，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，其余血清分裝后存放于-80℃冰箱。

1.4 小鼠神經(jīng)元制備及培養(yǎng)

15只新生乳鼠置于75%酒精中,使其窒息而死并消毒5 min，無菌分離大腦皮層，剪碎，用0.25%胰酶(含EDTA)37℃消化30 min，加入DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS)終止消化，70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)研磨、過濾，離心收集上清液，吹打分散細(xì)胞，以1×106mL-1接種于經(jīng)0.1 g·L-1多聚賴氨酸包被過夜的96孔板中[8-9]，每孔100 μL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液1次，第5天時(shí)加入終濃度2.5 μmol·L-1阿糖胞苷處理24 h抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長，第12天時(shí)神經(jīng)元鋪滿形成網(wǎng)絡(luò)狀，經(jīng)神經(jīng)絲蛋白-M(neurofilament protein NF-M)-DAPI檢測，神經(jīng)元純度在90%以上[10]。

1.5 MTT法檢測神經(jīng)元存活率

1.5.1 GP作用后神經(jīng)元存活率 Aβ1-40干粉溶于去離子水配成1 000 μmol·L-1溶液，37℃孵育7 d備用[11]。待神經(jīng)元培養(yǎng)至第12天成熟時(shí)，將96孔板內(nèi)細(xì)胞平均分成2份。一份用終濃度為30 μmol·L-1Aβ1-40(每孔20 μL)誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷，并將損傷后細(xì)胞隨機(jī)分為Aβ1-40模型組(Aβ1-40model，不加藥物)、GP組(GP 40、80、400、800及8 000 mg·L-1，每孔20 μL)、空白對照組(每孔加20 μL PBS)和正常對照組(未經(jīng)損傷的神經(jīng)元，正常加培養(yǎng)基培養(yǎng))，各做3個(gè)復(fù)孔，平行實(shí)驗(yàn)3次。另一份用終濃度為200 μmol·L-1H2O2(每孔20 μL)誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷，分組與操作同上，模型組為H2O2模型組(不加藥物)。

1.5.2 GP含藥血清作用后神經(jīng)元存活率 操作步驟同1.5.1，給藥組為GP含藥血清(1 g·kg-1·d-1GP灌胃后的小鼠血清，終濃度為5%、10%和15%，每孔20 μL)，對照組為空白小鼠(灌胃生理鹽水的小鼠)的血清。各組細(xì)胞孵育48 h后，于各孔加入20 μL終濃度5 g·L-1MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸凈孔內(nèi)液體，每孔加入150 μL DMSO，于酶標(biāo)儀上震蕩至深藍(lán)色結(jié)晶完全溶解，490 nm處測各孔吸光度(A)值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(A實(shí)驗(yàn)組/A正常組)×100%[12]，其中給藥組(人參蛋白組和人參蛋白含藥血清組)細(xì)胞存活率要扣除各自空白對照組細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=[A給藥組-(A空白組-A模型組)]/ A正常組×100%。

1.6 試劑盒法檢測神經(jīng)元NOS活性和NO水平

采用Aβ1-40和H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷，并加入80、400、800 mg·L-1GP及其1 g·kg-1·d-1給藥組小鼠5%、10%、15%含藥血清，孵育48 h后，吸取細(xì)胞上清液，按試劑盒說明書測定NOS活性(U·L-1)和NO水平(μmol·L-1)。

1.7 Heochst 33342/PI雙染色法檢測神經(jīng)元凋亡與壞死率

孵育48 h后的神經(jīng)元采用0.25%胰酶消化、離心，用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×105～1×106mL-1，吸取1 mL細(xì)胞，加入10 μL Heochst 33342染液(終濃度10 mg·L-1)，混勻，37℃孵育10 min，離心，棄上清，再加入1.0 mL PBS懸浮細(xì)胞，加入5 μL PI染液(終濃度20 mg·L-1)，混勻，避光染色10 min。取5 μL于玻片上，倒置熒光顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，區(qū)分活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)平行3次，計(jì)算凋亡率及壞死率。凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)神經(jīng)元總數(shù))×100%，壞死率=(壞死細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)神經(jīng)元總數(shù))×100%[13]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 GP作用后各組小鼠神經(jīng)元存活率

經(jīng)Aβ1-40處理后，小鼠神經(jīng)元存活率明顯降低(Plt;0.01)。除40 mg·L-1GP組與Aβ1-40模型組神經(jīng)元存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，其余各濃度GP組均較Aβ模型組細(xì)胞存活率明顯增加(Plt;0.01)；各濃度GP組大鼠細(xì)胞存活率均較H2O2模型組顯著增加，GP濃度增加并不會(huì)引起細(xì)胞存活率明顯增加，故初步選擇80、400和800 mg·L-1GP進(jìn)行下一步研究。見表1。

2.2 GP含藥血清作用后各組小鼠神經(jīng)元存活率 經(jīng)Aβ1-40和H2O2處理后，小鼠神經(jīng)元存活率明顯降低(Plt;0.01);加入終濃度5%、10%和15%GP含藥血清后，僅5%GP含藥血清組較H2O2模型組神經(jīng)元存活率增加(Plt;0.05)，其他各濃度GP含藥血清組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。見表2。

2.3 各組小鼠神經(jīng)元NOS活性與NO水平

經(jīng)Aβ1-40和H2O2損傷后，神經(jīng)元培養(yǎng)上清液中NOS活性及NO水平與空白對照組比較均明顯增加(Plt;0.01)；加入不同濃度GP后，NOS活性及NO水平與模型組比較均有不同程度降低(Plt;0.05或Plt;0.01)。見表3。

表1 GP作用后各組小鼠神經(jīng)元存活率

Tab.1 Survival rates of neurons of mice in various groups after treated with GP [n=3,η/(±s)%]

*Plt;0.01vsblank control group；△Plt;0.05,△△Plt;0.01vsmodel group.

2.4 各組小鼠神經(jīng)元凋亡與壞死率

經(jīng)Aβ1-40和H2O2處理后，神經(jīng)元出現(xiàn)胞體變圓、縮小，大小不等，核固縮、破裂，核染色質(zhì)聚集等凋亡形態(tài)學(xué)改變;Heochst 33342染色呈現(xiàn)高藍(lán)光；少量細(xì)胞壞死，PI染色呈現(xiàn)高紅光。加入GP及其含藥血清后，細(xì)胞凋亡數(shù)目與模型組比較明顯減少，400和800 mg·L-1GP組小鼠神經(jīng)元凋亡率與Aβ1-40模型組比較明顯降低(Plt;0.01)；80、400和800 mg·L-1GP組小鼠神經(jīng)元凋亡率較H2O2模型組明顯降低(Plt;0.05或Plt;0.01)。GP含藥血清組神經(jīng)元壞死率與Aβ1-40模型組和H2O2模型組比較雖有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。見圖1(插頁二)、表4和5。

表2 GP含藥血清作用后各組小鼠神經(jīng)元存活率

Tab.2 Survival rates of neurons of mice in various groups after treated with serum containing GP [n=3,η/(±s)%]

*Plt;0.01vsblank control group;△Plt;0.05vsmodel group.

表3 各組小鼠神經(jīng)元NOS活性和NO水平

GroupDose(mg·L-1)ActivityofNOS[λB/(U·L-1)]DamagedbyAβ1?40DamagedbyH2O2LevelofNO[cB/(μmol·L-1)]DamagedbyAβ1?40DamagedbyH2O2Blankcontrol 010．465±0．94110．465±1．00416．982±1．04216．982±1．324Model 015．349±1．113?18．206±1．633?35．221±3．262?40．022±2．548?GP8013．026±1．23316．826±1．55134．128±3．33533．124±2．041△40011．265±1．061△13．261±1．225△30．342±1．38926．828±1．881△△8009．688±0．816△△9．678±0．995△△25．685±1．967△21．306±1．956△△

*Plt;0.01vsblank control group；△Plt;0.05，△△Plt;0.01vsmodel group.

表4 GP作用后小鼠神經(jīng)元凋亡率和壞死率

GroupApoptoticrateDamagedbyAβ1?40DamagedbyH2O2NecroticrateDamagedbyAβ1?40DamagedbyH2O2Blankcontrol2．33±0．244．00±1．222．67±0．623．86±0．33Model57．28±3．87?49．72±3．98?20．94±2．62?22．55±2．08?GP 80mg·L-152．72±4．2941．11±1．23△21．78±2．2521．32±2．04 400mg·L-140．22±3．03△△33．94±2．08△△16．78±1．4318．43±1．92 800mg·L-130．89±2．45△△21．94±1．83△△15．50±1．0815．42±1．84

*Plt;0.01vsblank control group；△Plt;0.05,△△Plt;0.01vsmodel group.

3 討 論

神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能的基本單位，參與學(xué)習(xí)與記憶過程。Aβ1-40可引起神經(jīng)元變性和死亡，其產(chǎn)生與聚集是老年癡呆癥的重要病理學(xué)特征[14-15]。H2O2具有很強(qiáng)的氧化性，對神經(jīng)細(xì)胞有損害。本實(shí)驗(yàn)采用Aβ1-40和H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷，并研究GP對2種模型的保護(hù)作用，為GP抗衰老、抗老年癡呆等作用研究奠定基礎(chǔ)。

表5 GP含藥血清作用后小鼠神經(jīng)元凋亡率和壞死率

GroupApoptoticrateDamagedbyAβ1?40DamagedbyH2O2NecroticrateDamagedbyAβ1?40DamagedbyH2O2Control2．67±0．473．10±0．323．53±0．384．03±0．46Model56．94±3．15?49．13±5．02?28．56±2．12?26．06±2．62?GPmedicatedserum 5%49．17±2．4641．04±3．19△23．28±2．3919．88±2．29 10%40．44±4．34△44．16±4．3626．95±2．7621．95±2．46 15%45．56±4．9738．55±3．96△25．89±2．5424．89±2．54

*Plt;0.01vscontrol group；△Plt;0.05,△△Plt;0.01vsmodel group.

本實(shí)驗(yàn)所用GP為水溶性總蛋白，由于蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量較大，體內(nèi)能否吸收尚存在質(zhì)疑，因此，本文作者采用灌胃給藥方式制備小鼠GP含藥血清，并對其進(jìn)行相關(guān)藥理學(xué)研究。

MTT細(xì)胞活性檢測結(jié)果表明：GP及其含藥血清能提高細(xì)胞存活能力、減少細(xì)胞死亡；Hoechst 33342/PI熒光雙染和NOS活性、NO水平分析結(jié)果表明：GP及其含藥血清能抑制細(xì)胞凋亡、增加細(xì)胞抗氧化水平。提示GP能抵抗Aβ1-40和H2O2引起的神經(jīng)元損傷，其作用機(jī)制與抑制神經(jīng)元凋亡、提高細(xì)胞抗氧化水平等有關(guān)聯(lián)。GP含藥血清對神經(jīng)元的保護(hù)作用不及GP明顯，這可能是由于GP體內(nèi)吸收差，難以達(dá)到神經(jīng)元保護(hù)作用的有效血藥濃度，也可能是血清滅活過程中導(dǎo)致藥效降低，本文作者正在進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，GP具有神經(jīng)保護(hù)作用，具有抗衰老和治療退行性疾病的潛力，有必要開展相關(guān)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Protectiveeffectofginsengproteinonneuronsdamagedbyamyloid-βprotein1-40andH2O2anditsmechanism

LI Hong-yan1,CAO Yang2,BAI Xue-yuan3,ZHAO Dan1,ZHANG Xiao-dan1, YANG Jing-xian1,KANG Ting-guo1

(1. Department of Pharmacology,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China;2. Department of Detection,Huaxin Physical and Chemical Analysis Center CO.,Ltd, Dalian 116600，China;3. Chinese Medicine and Bioengineering Research Center,Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130117，China)

ObjectiveTo investigate the effect of ginseng protein (GP) on neurons damaged by beta amyloid protein1-40(Aβ1-40) and hydrogenperoxide (H2O2),and to clarify the neuroprotective effect of GP and its mechanism.MethodsThe primary neurons were isolated and purified from cerebral cortex of suckling mouse and cultured for 12 d,and damaged by 30 μmol·L-1Aβ1-40and 200 μmol·L-1H2O2. Then the damaged cells were randomly divided into model group (Aβ1-40model group and H2O2model group,no drugs),GP group and GP medicated serum group. MTT method was used to detect the survival rates of cells;Qiagen was used to detect the activities of NOS and levels of NO in culture supernatant,and Hoechst 33342/PI fluorescent staining method was used to detect the apoptotic and necrotic rates of cells.ResultsIt was observed that by the treatment of Aβ1-40and H2O2,the number of neuron was decreased,the axons shortened or disappeared,the karyopyknosis concentrated into a bright blue(dyed by Hoechst 33342),and some cells were dyed into red by PI under inverted flurescence microscope; after adding GP and its medicated serum,the number of cells was obviously increased,the cells stretched,the nuclei were round and light blue,and the number of cells dyed by PI into red was reduced. The MTT results showed that the survial rate of cells in GP group was obviously higher than that in model group (Plt;0.05 orPlt;0.01).There was no significant difference in the survival rate of cells between GP medicated serum group and model group (except 5% GP medicated serum group,Pgt;0.05). The activity of NOS and level of NO in culture supernatant in GP group were significantly lower than those in model group (Plt;0.05 orPlt;0.01). The apoptotic rates of cells in GP group and GP medicated serum group were obviously lower than that in model group detected by Hoechst 33342/PI method(Plt;0.05 orPlt;0.01). There was no significant differences of the necrotic rates of neurons between GP group, GP medicated group and model group(Pgt;0.05).ConclusionGP protein has the neuroprotective effect,and its mechanism is related to the reduction of the activity of NOS and the level of NO and the inhibition of apoptosis of neurons.

ginseng protein;serum;neuron;amyloid-β protein;apoptosis

1671-587Ⅹ(2013)06-1138-05

10.7694/jldxyxb20130611

2013-04-07

中國博士后基金資助課題(2013M530945)；遼寧省科技廳科研項(xiàng)目資助課題(2008226011-1)

李紅艷(1982-)，女，內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市人，講師，中藥學(xué)博士，主要從事中藥藥理學(xué)研究。

康廷國(Tel：0411-87586078，E-mail：kangtg@126.com)；

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