程秀芳,朱麗梅,李 丹,谷 巍
(山東寶來利來生物工程股份有限公司,山東 泰安 271000)
隨著飼料工業(yè)不斷發(fā)展,動物性蛋白原料日漸短缺,因而開發(fā)新的植物源蛋白顯得尤為重要。豆粕是應用最為廣泛的植物飼料蛋白質資源,蛋白質含量高,但豆粕的使用僅限于成年動物,因為幼畜很難消化大豆蛋白。棉粕是棉籽經脫殼、加熱、壓扁成薄片用溶劑己烷浸出油后所剩余的副產品,蛋白質含量豐富,是優(yōu)良的植物源蛋白,由于棉粕中含有對動物有害的游離棉酚,會對動物的生長發(fā)育和繁殖造成不良影響[1],也含有難以消化的纖維素、半纖維素、植酸等抗營養(yǎng)因子[2],限制了在動物飼料中的應用。因此,降解棉粕中的游離棉酚并通過降解蛋白質提高氨基酸及小肽含量,最終提高棉粕利用率是當前研究的熱點之一。孫建義等[3]利用單一菌株假絲酵母菌發(fā)酵可對棉粕進行脫毒處理;程福亮等[4]用需氧和厭氧聯(lián)合發(fā)酵提高動物性蛋白原料利用率進行了初步研究,但用兩株菌進行有氧和無氧聯(lián)合發(fā)酵的研究報道仍然極少。本研究采用固態(tài)聯(lián)合發(fā)酵的方法,將枯草芽孢菌納豆菌(BacillussubtilisNDX6)接入豆粕、棉粕中,按不同比例混合后進行有氧發(fā)酵,再接入植物乳桿菌(LactobacillusplantarumBLLP)進行無氧發(fā)酵,試圖提高氨基酸及小肽的含量,降低棉粕中游離棉酚的含量,為棉粕脫毒處理提供參考。
供試菌株分別為枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisNDX6)和植物乳酸桿菌(LactobacillusplantarumBLLP),由山東寶來利來生物工程股份有限公司研究院保存,其中枯草芽胞桿菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,植物乳酸桿菌發(fā)酵用乳酸菌培養(yǎng)基(MRS)。
1.2.1 種子液制備 (1)枯草芽孢桿菌NDX6菌種子液制備。取經過兩次活化的斜面菌種一環(huán)約0.05 g于裝有100 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,于37 ℃ 180 r/min搖床培養(yǎng)24 h,待用。取經過兩次活化斜面菌種一環(huán)于盛有100 mL乳酸菌培養(yǎng)基的鹽水瓶中,于37 ℃靜止培養(yǎng)24 h,待用。(2)植物乳酸桿菌BLLP的種子液制備。取經過兩次活化斜面菌種一環(huán)于盛有100 mL乳酸菌培養(yǎng)基的鹽水瓶中,于37 ℃靜止培養(yǎng)24 h。
1.2.2 固態(tài)聯(lián)合發(fā)酵方法 有氧發(fā)酵配料:稱取一定量的原料,豆粕和棉粕按不同的比例混合,分別測定各個配方中的粗蛋白、游離氨基酸和水分,將粗蛋白、游離氨基酸以絕干計。
將各個配方的原料混合均勻裝于罐頭瓶中,裝量50 g/瓶,3個平行樣品,料水比為1∶0.8,121 ℃滅菌20 min后取出,使其自然冷卻,當溫度降至40 ℃左右時接入BNDX6菌,37 ℃發(fā)酵36 h后,有氧發(fā)酵結束。取樣,將樣品分成兩部分一部分用于計數(shù),一部分樣品50 ℃低溫烘干,測定游離氨基酸和水分,游離氨基酸以絕干計。
無氧發(fā)酵:有氧發(fā)酵結束,取樣以備檢測,然后接種植物乳桿菌BLLP,轉入無氧發(fā)酵60 h后結束,取樣分成兩份,一份用于測定乳酸菌活菌數(shù)、pH值,另一份50 ℃低溫烘干后,測定游離氨基酸、游離棉酚去除率、粗蛋白,聯(lián)合發(fā)酵結束。
1.2.3 配方最佳比例篩選 在豆粕與棉粕的混合原料中,設計六個配方為A-F,每個配方3個平行,豆粕的含量分別為0%、20%、40%、60%、80%、100%,相對應的棉粕的含量分別為100%、80%、60%、40%、20%、0%,分別在有氧發(fā)酵和無氧發(fā)酵后取樣,檢測游離氨基酸和游離棉酚,取其平均值。
1.2.4 固態(tài)聯(lián)合發(fā)酵的生長曲線 以有氧發(fā)酵12 h后開始取樣,分別在18 h、22 h、26 h、30 h、34 h、38 h、42 h、46 h、50 h取樣,50 ℃低溫烘干,測定游離氨基酸、游離棉酚。
以厭氧發(fā)酵開始起點為0 h,在0 h、24 h 、36 h、48 h、54 h、60 h、66 h、78 h取樣,50 ℃低溫烘干,測定游離氨基酸和游離棉酚,根據(jù)兩指標確定最佳發(fā)酵時間。
1.2.5 測定方法 游離氨基酸的測定(以氮計)采用電位滴定法;
活菌數(shù)測定采用平板計數(shù)法;
游離棉酚測定采用苯胺法(據(jù)國標GB13086-91)
豆粕和棉粕按不同比例混合進行有氧發(fā)酵和無氧發(fā)酵后,測定游離棉酚、水溶蛋白(游離氨基酸)、活菌數(shù)、pH、粗蛋白,試驗結果分別見表1、表2、表3、圖1、圖2。
表1 聯(lián)合發(fā)酵過程中游離棉酚變化Table 1 Change of free gossypol in the process of fermentation mg/g
注:同行肩標相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。
Note:Values with the same lowercase superscripts in the same column were insignificantly different(P>0.05),those with different lowercase superscripts in the same column were significant difference(P<0.05)﹒The same below.
由表1可知,配方A有氧發(fā)酵前后差異顯著(P<0.05),游離棉酚降低了約35%,無氧發(fā)酵前后比較差異顯著(P<0.05),游離棉酚降低約71%;通過聯(lián)合發(fā)酵后游離棉酚由6.20 mg/g降到1.18 mg/g約81%;配方B在有氧發(fā)酵前后比較差異顯著(P<0.05)比發(fā)酵前降低了約32%,但在無氧發(fā)酵后顯著的升高(P<0.05)約15.7%,整個聯(lián)合發(fā)酵過程降低了約21%;而配方C、D、E都有不同程度的升高。因此在游離棉酚的去除方面來看,以配方A為最佳。
由表2可知,各配方有氧發(fā)酵和無氧發(fā)酵中游離氨基酸含量都有顯著差異(P<0.05),配方A在聯(lián)合發(fā)酵后游離氨基酸約升高6.5倍,配方B約升高8.4倍,配方C、D、E、F分別升高9倍、8.8倍,8.0倍和5.4倍。因此,聯(lián)合發(fā)酵能夠提高游離氨基酸的含量。
聯(lián)合發(fā)酵中需氧和厭氧發(fā)酵后活菌數(shù)見圖1。由圖1可知,有氧發(fā)酵后六個配方的活菌數(shù)并不高,但是經過無氧發(fā)酵后,配方A、B、C、D、E微生物活菌數(shù)有所升高,配方A升高了約17倍,特別是配方C活菌數(shù)升高了約24倍,因此,無氧發(fā)酵對提高活菌數(shù)有很重要的意義。
表2 合發(fā)酵過程中游離氨基酸含量變化Table 2 Change of free gossypol in the process of fermentation mg/g
圖1 各配方在有氧發(fā)酵與無氧發(fā)酵前、后活菌數(shù)變化Fig.1 The formula of living bacteria number changes before and afrer aerobic fermentation and anaerobic fermentation
聯(lián)合發(fā)酵前后pH變化見表3。由表3可知,聯(lián)合發(fā)酵后可以降低飼料的pH。
聯(lián)合發(fā)酵前后粗蛋白的變化見圖2。由圖2知,聯(lián)合發(fā)酵后粗蛋白的含量比聯(lián)合發(fā)酵前的粗蛋白含量都有所提高,其中以配方A和配方F提高的較多分別約為8%、5%。
在有氧發(fā)酵和無氧發(fā)酵中,6個配方都能夠顯著地提高游離氨基酸的含量,無氧發(fā)酵中能夠顯著地提高發(fā)酵物中的活菌數(shù),降低發(fā)酵物的pH;6個配方的發(fā)酵過程中,配方A純棉粕發(fā)酵后的游離棉酚,在有氧發(fā)酵及無氧發(fā)酵都能夠降解游離棉酚的含量,由原來的6.2 mg/g降解到1.18 mg/g,比原來降低了約81%,因此配方A為最佳配方。
表3 發(fā)酵前后pH變化 Table 3 Change of pH before and after fermentation
圖2 聯(lián)合發(fā)酵前后蛋白質含量變化Fig.2 Changes of protein content before and after combined fermentation
2.2.1 有氧發(fā)酵不同時間點游離棉酚和游離氨基酸變化曲線 由圖3可知,有氧發(fā)酵中發(fā)酵時間在30 h后游離氨棉酚明顯降低,游離氨基酸明顯升高,在38 h時游離棉酚降至最低,以后趨于平穩(wěn);游離氨基酸在18 h~22 h明顯升高,22 h后逐漸升高,38 h升至最高,以后趨于平穩(wěn),升高不明顯。綜合兩項指標確定發(fā)酵時間為38 h為有氧發(fā)酵的最佳時間。
2.2.2 無氧發(fā)酵中游離棉酚和游離氨基酸隨發(fā)酵時間的變化曲線 由圖4知,在無氧發(fā)酵中,游離棉酚含量在36 h后明顯降低,60 h后趨于平穩(wěn),66 h降至最低,后又趨于平穩(wěn);游離氨基酸在24 h后明顯升高,36 h后趨于平緩升高,60 h升至最高,在78 h后下降明顯;因此,在無氧發(fā)酵中發(fā)酵最佳時間為60~66 h。游離氨基酸比發(fā)酵前游離氨基酸含量提高6.26倍,游離棉酚降低約80%。
圖3 有氧發(fā)酵中游離棉酚和游離氨基酸隨發(fā)酵時間的變化 Fig.3 Changes of the contents of free gossypol and free amino acid in anaerobic fermentation accompanying different fermentation time
圖4 無氧發(fā)酵中游離氨基酸和游離棉酚隨發(fā)酵時間的變化Fig. 4 Changes of the anaerobic fermentation of free amino acid and free gossypol content in different fermentation time
隨著近幾年來研究的不斷深入,棉酚脫除技術越來越多,包括物理法、化學法、溶劑浸出法、生物脫毒法等。物理法中的高溫法和擠壓法在降低毒性物質游離棉酚的同時,也降低棉籽餅殘油率,從棉籽餅綜合利用角度考慮,此方法受到了限制;添加硫酸亞鐵、尿素、堿、石灰水等也可脫毒即為化學法,其中最常用的是堿法和硫酸亞鐵法。缺點:只能去除游離棉酚,棉酚總量不會發(fā)生變化。溶劑浸出法對飼料加工企業(yè)來說費用高不可取。
利用微生物發(fā)酵—枯草芽孢桿菌NDX6不但能夠降低游離棉酚的含量,并且能夠大大降解蛋白、提高游離氨基酸及小肽的含量,提高菌體蛋白的含量,從而提高飼料消化吸收的生物利用度,而且經濟、環(huán)保。
純棉籽粕利用乳酸菌無氧條件下發(fā)酵也能夠降解部分游離棉酚,而且無氧發(fā)酵還能夠降低飼料的pH;提高發(fā)酵飼料中的乳酸菌的活菌數(shù),增加有益菌;從而能夠酸化動物腸道pH,增加優(yōu)勢菌群,通過競爭抑制有害菌的生長,有效的預防動物腸道疾病的發(fā)生,增強動物的免疫力。pH的降低是由于在乳酸菌發(fā)酵過程中產生了乳酸、乙酸等小分子的有機酸,對酸化動物的腸道,抑制病原菌的繁殖起到很重要的意義。
總之,將棉粕利用固體聯(lián)合發(fā)酵可以降低毒素-游離棉酚的含量,降解蛋白、提高飼料吸收利用率,增加腸道優(yōu)勢菌從而對動物的腸道疾病起到很好的保健作用。
如何將固體聯(lián)合發(fā)酵工業(yè)化大規(guī)模生產,提高棉粕的利用率,需要怎樣的生產設備達到規(guī)?;a,還需要進一步的試驗研究。
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