辛清武，繆中緯，鄭嫩珠，朱志明，黃勤樓

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013)

產(chǎn)蛋量是家禽的一個極為重要的數(shù)量性狀，屬于限制性狀和低遺傳力性狀。黑番鴨年產(chǎn)蛋量較低，僅90枚左右，其較強的就巢性是繁殖力較低的主要原因。由于家禽就巢性狀的遺傳力較低，國內(nèi)外眾多家禽研究者將目光集中在與生殖內(nèi)分泌相關(guān)的基因上，以期闡明家禽的就巢機制，降低或阻止家禽就巢來提高繁殖力。

催乳素(prolactin，PRL) 被認為是引起家禽就巢行為發(fā)生和維持的關(guān)鍵因素，而血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)是公認的PRL釋放因子，能促進PRL的分泌[1-8]。VIP通過位于細胞膜上的受體(vasoactive intestinal peptide receptor，VIPR)發(fā)揮其生理功能，已經(jīng)證明禽類腺垂體PRL細胞的細胞膜上有VIPR-1，VIPR-1與VIP 在腺垂體特異性結(jié)合是引起PRL重新合成與分泌的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的第一步[9-10]。目前，國內(nèi)外對黑番鴨及家鴨VIPR-1基因的報道極少，鄭嫩珠等[11]對黑番鴨VIPR-1的cDNA序列進行了克隆，并獲得黑番鴨的部分cDNA序列。辛清武等[12]以黑番鴨基因組為模板進行PCR擴增，獲取了黑番鴨VIPR-1基因第5外顯子(101 bp)、第5內(nèi)含子 (1 630 bp) 、第6外顯子 (133 bp)、第12外顯子 (42 bp)、第12內(nèi)含子 (1 455 bp) 的完整序列和第13外顯子 (176 bp) 的部分序列。

本研究以鴨VIPR-1基因作為影響鴨就巢性狀的候選基因，選用就巢黑番鴨和非就巢黑番鴨為研究對象，通過PCR-RFLP和測序方法，對VIPR-1基因進行多態(tài)性檢測，并進行相關(guān)性分析，研究該基因?qū)诜喚统残袨榈挠绊?，為黑番鴨的保護、開發(fā)利用及分子標(biāo)記輔助育種工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

本研究以黑番鴨為試驗材料，頸靜脈采血，提取總DNA，設(shè)計引物進行PCR擴增并采取PCR產(chǎn)物直接測序的方法尋找突變位點，然后再對PCR產(chǎn)物進行酶切與判型。

1.1 試驗材料

選取就巢期黑番鴨68只，非就巢黑番鴨108只，采用頸靜脈采血，EDTA抗凝，-20 ℃保存。基因組DNA試劑盒提取總DNA，TE溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆?。試驗鴨飼養(yǎng)于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所種鴨示范基地-福建省莆田市泉發(fā)種禽開發(fā)有限公司，分子生物學(xué)試驗在福建省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所省畜禽分子遺傳育種實驗室進行。

1.2 主要試劑

血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒均購自TIANGEN公司；DreamTaqGreenPCRMasterMix(2×)、Nuclease-freewater購自廈門鷺隆生物科技發(fā)展有限公司；pMD18-T載體、DNA Marker(DL1000、DL500)、限制性內(nèi)切酶StuI均購自大連TAKARA公司。

1.3 黑番鴨VIPR-1基因多態(tài)位點及其引物

根據(jù)已克隆的黑番鴨VIPR-1基因內(nèi)含子12的序列，設(shè)計一對引物，進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物直接測序，尋找該序列的突變位點并進行酶切見表1。

1.4 PCR擴增

應(yīng)用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取健康就巢黑番鴨68只、非就巢黑番鴨108只血液基因組DNA，進行PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)體系為50 μL：2 × Taq MasterMix 25 μL，上游引物(F) 1 μL，下游引物(R)1 μL，模板 DNA 2 μL ，補充ddH2O 至終體積50 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 50 s，53.5℃ 35 s，72℃ 45 s，共 35 個循環(huán); 72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果。

表1 PCR引物序列信息Table 1 The amplification primer sequences

1.5 PCR產(chǎn)物的酶切與判型

將擴增結(jié)果良好的PCR產(chǎn)物用StuI酶切，反應(yīng)體系為：10×M Buffer 2 μL，PCR產(chǎn)物10 μL，StuI 1 μL，加水至20 μL，37 ℃恒溫水浴鍋中消化過夜；3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用DL1000和DL500的DNA Marker作為分子量的標(biāo)準(zhǔn)對照，觀察酶切結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)拍照，由帶型判斷基因型。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

計算各多態(tài)片段的基因頻率和基因型頻率，并用x2檢驗對不同基因型在非就巢和就巢黑番鴨中的分布情況進行顯著性分析。

基因型頻率 PAA=XAA/n；基因頻率PA=(2PAA+PAG)/2n 。式中：n 為基因型總數(shù)量；XAA為其中一種基因型數(shù)目；PAA為AA 基因型的頻率；PA為等位基因A的基因頻率。

x2=n(ad-bc)^2/[(a+b)(c+d)(a+c)(b+d)]

式中：n=a+b+c+d為樣本容量。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增與測序

所提取的血樣DNA經(jīng)檢測純度較高，可用于PCR擴增。PCR擴增結(jié)果如圖1所示，擴增產(chǎn)物長度介于500～700 bp，擴增片段與預(yù)期片段大小一致且特異性較好，沒有非特異性條帶見圖1，引物P的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后送往大連TAKARA公司進行測序，經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)片段中有一個核苷酸突變見圖2，位于黑番鴨VIPR-1基因第12內(nèi)含子的第988 bp(A/G)處，多態(tài)性即由此產(chǎn)生。

圖1 PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果M.Marker DL1000;1-10.PCR 產(chǎn)物Fig.1 Electrophoresis of PCR productM.Marker DL1000;1-10.PCR product

2.2 酶切結(jié)果

PCR產(chǎn)物特異性較好，沒有非特異性條帶，可用于StuI限制性內(nèi)切酶消化。經(jīng)StuI酶切該PCR產(chǎn)物后，瓊脂糖凝膠電泳檢測，該位點表現(xiàn)為多態(tài)性，出現(xiàn)了AG、AA、GG 3種基因型，依據(jù)條帶數(shù)和位置判定為3種基因型。其中等位基因A表現(xiàn)為607 bp一條帶；等位基因B表現(xiàn)為362 bp、245 bp兩條帶，即有1個StuI酶切位點。因此，AA基因型個體表現(xiàn)為1條帶(607 bp)，GG基因型個體表現(xiàn)為2條帶(362 bp、245 bp)，AG基因型個體表現(xiàn)為3條帶(607 bp、362 bp、245 bp)。就巢黑番鴨、非就巢黑番鴨部分酶切結(jié)果見圖3。

圖3 VIPR-1基因擴增產(chǎn)物的部分StuI酶切結(jié)果1，2，6，9，12，16，19，21.AG基因型；3，4，14，17，18.AA基因型；5，7，8，10，11，13，15，20，22.GG 基因型；M.Marker DL 500Fig.3 Profiles of PCR products digested by StuI of VIPR-1 gene1，2，6，9，12，16，19，21.AG genotype；3，4，14，17，18.AA genotype；5，7，8，10，11，13，15，20，22.GG genotype；M.Marker DL 500

2.3 SNPs與就巢性狀的關(guān)系

VIPR-1基因內(nèi)含子12片段經(jīng)PCR-RFLP分析，在黑番鴨試驗鴨群中檢測到SNPs，其基因型分布情況詳見表2。對黑番鴨試驗鴨群進行SNPs基因型的檢測，統(tǒng)計黑番鴨VIPR-1就巢與非就巢性狀的基因型分布情況并進行卡方獨立性檢驗。黑番鴨就巢與非就巢性狀基因型分布結(jié)果見表3?？ǚ姜毩⑿詸z驗結(jié)果表明黑番鴨VIPR-1基因第12內(nèi)含子的第988 bp(A/G)處突變各基因型分布在就巢與非就巢性狀中差異極顯著(P<0.01)。

表2 內(nèi)含子12片段的基因型頻率和等位基因頻率Table 2 Genotype and allele frequence of intron 12

表3 黑番鴨VIPR-1各基因型分布與就巢性狀的關(guān)系Table 3 Distribution of genotype and appearance of broodiness in the balck Mouscovy duck

3 討 論

血管活性腸肽受體-1(VIPR-1)與血管活性腸肽(VIP)在腺垂體特異性結(jié)合，可引起PRL的重新合成與分泌，可能對家禽的就巢有著重要的影響。因此，VIPR-1基因可作為研究家禽就巢性狀的重要候選基因。You等[10]克隆出火雞VIPR基因cDNA全序列，分析了VIPR在火雞不同繁殖時期在下丘腦和垂體中的表達規(guī)律，并得出VIPR在垂體中表達量的變化與火雞就巢密切相關(guān)。周敏等[13-16]研究雞VIPR基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)雞VIPR基因存在多態(tài)位點，這些多態(tài)位點與雞就巢的發(fā)生和持續(xù)時間顯著相關(guān)；通過對VIPR-1基因C1704887T和C1715301T多態(tài)位點與優(yōu)質(zhì)肉雞清遠麻雞雞群開產(chǎn)性狀、產(chǎn)蛋性狀以及就巢性狀的相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)位點C1704887T對總產(chǎn)蛋數(shù)與總正常蛋數(shù)存在顯著影響；在選取VIPR-1基因的12個多態(tài)位點與優(yōu)質(zhì)肉雞寧都三黃雞群早期產(chǎn)蛋性狀的相關(guān)分析中，發(fā)現(xiàn)有3個多態(tài)位點不同基因型對母雞的早期產(chǎn)蛋性狀存在顯著影響；同時通過對雞VIPR-1基因5’(-496～-1 bp)調(diào)控區(qū)多態(tài)位點與雞就巢性的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)多態(tài)以及單倍型組合與就巢性狀緊密相關(guān)，可作為影響肉雞就巢行為的候選基因進行深入研究。

本研究以與黑番鴨就巢相關(guān)的VIPR-1基因作為候選基因，利用PCR-RFLP和PCR產(chǎn)物直接測序法分析了該基因內(nèi)含子12的核苷酸變異，經(jīng)StuI酶切該PCR產(chǎn)物后，瓊脂糖凝膠電泳檢測，該位點表現(xiàn)為多態(tài)性，出現(xiàn)了AG、AA、GG 3種基因型，依據(jù)條帶數(shù)和位置判定為3種基因型。其中等位基因A表現(xiàn)為607 bp一條帶；等位基因G表現(xiàn)為362 bp、245 bp兩條帶，即有1個StuI酶切位點。通過對就巢黑番鴨與非就巢黑番鴨個體的研究，發(fā)現(xiàn)就巢黑番鴨只有一種基因型AG(68),而非就巢黑番鴨除基因型AG(45)外，還有基因型AA(18)、GG(45)，經(jīng)卡方獨立性檢驗，就巢黑番鴨與非就巢黑番鴨兩者之間基因型的分布差異極顯著(P<0.01)。表明黑番鴨VIPR-1基因第12內(nèi)含子A988G突變與黑番鴨的就巢性狀顯著相關(guān)，為利用分子遺傳標(biāo)記輔助選擇來降低或消除黑番鴨的就巢性，最大程度上提高黑番鴨的產(chǎn)蛋性能提供了新的依據(jù)。

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