馬 力, 楊麗梅, 郭時金, 沈志強*, 李 峰, 張 穎, 徐倩倩, 張志美, 王艷萍

(1. 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州256600；2. 山東綠都安特動物藥業(yè)有限公司，山東，濱州256600)

鴨腸炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)又名鴨瘟病毒(Duck plague virus，DPV)、鴨皰疹病毒1型(Anatid herpesivirus 1，AnHV-1)是鴨病毒性腸炎(Duck viral enteritis，DVE)，俗稱鴨瘟(Duck plague，DP)的致病原[1-2]。鴨病毒性腸炎自1923年在荷蘭首次暴發(fā)后，逐漸向全球范圍內擴散，現已呈世界范圍內流行，我國于1957年在廣州首次發(fā)現，現主要流行于華東、華中、華南等養(yǎng)鴨密集地區(qū)。該病具有較高的發(fā)病率與死亡率，是阻礙我國養(yǎng)鴨業(yè)健康發(fā)展的主要疫病之一，每年都給國內家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經濟損失，世界動物衛(wèi)生組織將該病列為B類動物疫病，我國農業(yè)部獸醫(yī)局將其確定為三類動物傳染病[3-8]。鴨腸炎病毒是皰疹病毒科(Herpesviridae)α-皰疹病毒亞科(Alpha-herpesvirinae)的典型代表病毒，是具有核衣殼和囊膜的雙股DNA病毒[9-10]。其中gB蛋白是DEV最保守的囊膜蛋白，為病毒吸附、穿入、融合細胞以及細胞間傳播的必需蛋白，同時其表面的抗原決定簇能夠誘導機體產生高水平的體液免疫反應，具有良好的反應活性及免疫原性，在皰疹病毒的診斷、防治等方面具有巨大的應用價值和廣闊的應用前景[11-12]。鑒于此，本研究對gB基因進行了截短表達、純化以及活性鑒定，并初步建立了檢測鴨腸炎病毒抗體的間接ELISA診斷方法，為鴨腸炎病毒診斷試劑盒的開發(fā)應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌毒株、載體及血清

克隆菌株DH5α感受態(tài)細胞、表達菌株BL21(DE3) 感受態(tài)細胞由山東省濱州獸醫(yī)生物技術重點實驗室制備并保存；鴨腸炎病毒(DEV)弱毒疫苗株由山東綠都生物科技有限公司提供；克隆載體pMD18-T購自寶生物(大連)工程有限公司；原核表達載體pET30a由山東省濱州獸醫(yī)生物技術重點實驗室保存；鴨腸炎病毒陽性及陰性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察管理所。

1.2 試 劑

Taq DNA 聚合酶、BamH I與Hind III內切酶、T4 DNA連接酶購自寶生物(大連)工程有限公司；蛋白酶K購自生工生物工程(上海)股份有限公司；凝膠回收試劑盒、病毒基因組DNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒北京百泰克生物技術有限公司；鎳離子親和層析柱購自GE Healthcare。

1.3 引物設計與合成

根據GenBank公布的DEV基因組序列，用DNAstar生物學軟件對DEV gB基因的抗原區(qū)、親水區(qū)及表面展示概率進行分析，利用oligo6.2設計擴增gB基因的一對引物(加線部分表示引入的酶切位點)P1 5'-3'ATAGGATCCGGCTATGGACCAACCGAATCT；P2 5'-3' ATTCAAGCTTCTCTGCCCATAGAACGCTCTC，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.4 病毒的增殖

將DEV經絨毛尿囊膜接種10日齡鴨胚，收集72～120 h含痘斑的鴨胚尿囊膜和鴨胚尿囊液，將尿囊膜剪碎研磨后用尿囊液制成懸液，反復凍融3次，然后于4 ℃ 12 000 r/min 離心20 min，取上清，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病毒基因組DNA的提取

取上述保存病毒液500 μL，按病毒基因組DNA提取試劑盒的使用說明提取DEV基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 gB基因的PCR擴增、克隆與鑒定

以提取的病毒基因組DNA為模板，用設計的引物PCR擴增gB基因，PCR反應條件為：94 ℃ 5 min預變性、94 ℃ l min、55 ℃ l min、72 ℃ l min，共進行30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應。PCR擴增產物經膠回收試劑盒純化后連接至pMD18-T載體，轉化克隆菌株DH5α感受態(tài)細胞，用質粒提取試劑盒提取質粒，進行PCR及BamH I/Hind III雙酶切鑒定，將鑒定正確的陽性重組質粒命名為pMD18-T-gB，將其送生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定。

1.7 gB基因原核表達載體的構建與鑒定

利用測序鑒定正確的pMD18-T-gB陽性重組質粒經BamH I/Hind III雙酶切后，回收855 bp的gB基因片段，用T4 DNA連接酶于22 ℃過夜連接至經BamH I/Hind III雙酶切的pET30a原核表達載體中，轉化克隆菌株DH5α感受態(tài)細胞，用質粒提取試劑盒提取質粒，進行PCR及BamH I/Hind III雙酶切鑒定，將鑒定正確的陽性重組質粒命名為pET30a-gB。

1.8 pET30a-gB重組蛋白表達條件的優(yōu)化

將鑒定正確的pET30a-gB陽性重組質粒轉化表達菌株BL21(DE3) 感受態(tài)細胞，采用不同誘導劑濃度、不同時間、不同溫度誘導pET30a-gB重組蛋白的表達。經SDS-PAGE電泳分析，確定最佳的誘導劑濃度、誘導時間、誘導溫度。

1.9 pET30a-gB重組蛋白表達形式的鑒定

以最佳誘導條件表達后，用超聲波裂解細胞。超聲波作用5 s，間隔5s，共作用60次。然后以12 000 r/min離心20 min，分別收集沉淀與上清進行SDS-PAGE電泳分析檢測，鑒定目的蛋白是以包涵體形式存在于沉淀中，還是以可溶性形式存在于上清中。

1.10 pET30a-gB重組蛋白的純化

對以包涵體形式表達的重組蛋白采用不同濃度的尿素進行變性處理，確定能夠溶解包涵體的最適尿素濃度。包涵體溶解后采用鎳離子親和層析法純化，純化蛋白透析復性，對復性后的純化蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測分析，Bradford法測定純化蛋白的濃度。

1.11 pET30a-gB重組蛋白的Western blot活性檢測

依次取純化的pET30a-gB重組蛋白、pET30a空載體誘導表達菌、純化的pET30a-gB重組蛋白和pET30a空載體誘導表達菌進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后轉印至硝酸纖維素膜上，過夜封閉后，沿硝酸纖維素膜中間剪開，分別與1∶100倍稀釋的鴨腸炎病毒陽性血清、陰性血清反應，洗滌后，與1∶4 000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的兔抗鴨IgG反應，洗滌后，在3'-二氨基聯苯胺緩沖液中進行顯色。

1.12 間接ELISA檢測方法的初步建立與應用

以純化的重組gB蛋白作為包被抗原、鴨腸炎病毒陽性與陰性血清蛋白作為一抗、HRP標記兔抗鴨酶標抗體為二抗，采用方陣滴定法測定抗原抗體的最佳工作濃度與作用時間，以建立的間接ELISA檢測方法，與病毒中和試驗同時對86份鴨血清進行檢測，計算二者的符合率。

2 結 果

2.1 gB基因PCR擴增結果

如圖1所示，gB基因PCR擴增產物經凝膠成像掃描分析系統(tǒng)掃描顯示在位于855 bp大小處可見的特異性DNA擴增片段，與試驗的預期結果相一致。

2.2 gB基因克隆與鑒定結果

如圖2所示，構建的pMD18-T-gB質粒經PCR鑒定可明顯擴增出855 bp DNA片段，經BamH I/Hind III雙酶切鑒定可明顯切出855 bp DNA片段，重組質粒pMD18-T-gB的測序表明插入T載體中的序列與參考毒株相同。

圖1 PCR擴增結果M.DNA標準DL 2000;1.gB基因PCR擴增產物; 2.對照Fig.1 Result of PCR Amplification

M.DNA Marker DL 2000; 1.Product of PCR;2.control

圖2 克隆載體的鑒定M.DNA標準DL 2000;1.對照;2.PCR鑒定;3.質粒pMD-gB BamH I/Hind III酶切Fig.2 Identification of recombinant cloning vector

M.DNA Marker DL 2000; 1.Control;2.Product of recombinant plasmid PCR;3.Recombinant plasmid digested by BamH I/Hind III

2.3 gB基因表達載體的鑒定結果

如圖3所示，構建的pET30a-gB重組質粒經PCR鑒定可明顯擴增出855 bp DNA片段，經BamH I/Hind III雙酶切鑒定可明顯切出約5900 bp和855 bp兩條片段，與預期結果相符，表明表達載體構建成功。

2.4 pET30a-gB重組蛋白的最佳表達條件的確定

經SDS-PAGE電泳確定重組蛋白的最佳誘導溫度為 37 ℃、最佳誘導劑濃度為 1.0 mmol/L、最佳誘導時間為5 h，所表達蛋白的分子量約為39 ku，與預期大小相符。

2.5 pET30a-gB重組蛋白表達形式的鑒定結果

以最佳條件誘導表達后，超聲裂解細胞，分別收集沉淀及上清進行SDS-PAGE電泳檢測，得到pET30a-gB重組蛋白是以包涵體形式表達的見圖4。

圖3 表達載體的鑒定M1.DNA標準DL15 000; M2.DNA標準DL 2 000;1.對照;2.PCR產物;3.質粒pET30a-gB經BamH I/HindIII酶切;4.pET30a載體BamH I/Hind III酶切Fig.3 Identification of recombinant expression vectorM1.DNA Marker DL 15 000;M2.DNA MarkerDL 2 000;1.Control;2.Product of recombinant expressionvector PCR;3.Recombinant expression vector digestedby BamH I/Hind IIII.4.pET30a vector digestedby BamH I/Hind III

圖4 重組蛋白的SDS-PAGE分析M.蛋白分子質量標準;1.pET30a表達產物對照;2.pET30a-gB未誘導對照;3.pET30a-gB表達產物;4.超聲破碎后上清;5.超聲破碎后沉淀 Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombination protein

M.Protein molecular weight Marker;1.Expression product of pET30a;2.Non induced control of pET30a-gB；3.Expression product of pET30a-gB;4.Supernatant after ultrasonic disruption; 5.Pellets after ultrasonic disruption

2.6 pET30a-gB重組蛋白的純化

2.6.1 包涵體蛋白的變性處理 以2、4、5、6、8 mol/L不同濃度尿素溶解包涵體，如圖5所示，在尿素為4 mol/L時，包涵體中有極少量的一部分開始溶解，8 mol/L時包涵體完全溶解。最后確定用4 mol/L尿素洗滌包涵體，用8 mol/L尿素溶解包涵體。

2.6.2 包涵體溶解后的純化與復性 包涵體溶解后，采用鎳離子親和層析柱對其進行純化，對純化后的蛋白采用6M、4M、2M尿素及PBS進行梯度透析復性，對復性前后的蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測，結果顯示目的蛋白得到了純化見(圖6)，Bradford法測定純化蛋白的濃度為0.516 mg/mL。

2.7 pET30a-gB重組蛋白的Western blot活性鑒定

如圖7所示，pET30a-gB重組純化蛋白能與鴨腸炎病毒陽性血清發(fā)生特異性反應，而與鴨腸炎病毒陰性血清不發(fā)生反應，同時pET30a空載體誘導表達菌與鴨腸炎病毒陽性血清、陰性血清均不發(fā)生反應，pET30a-gB重組純化蛋白表現出了良好的活性與特異性。

2.8 間接ELISA檢測方法的建立與應用結果

經過方陣滴定試驗確定重組抗原最佳包被濃度為2.58 μg/mL；血清最佳稀釋度為1∶100，酶標二抗最佳工作濃度為1∶4000，最佳作用時間為37 ℃ 1 h，以建立的間接ELISA檢測方法與病毒中和試驗檢測86份鴨血清樣品，間接ELISA檢測出陽性62份，陰性24份；病毒中和試驗檢測出陽性60份，陰性26份，二者的符合率為97.67 %。

圖5 包涵體用不同濃度尿素的溶解分析1-2.包涵體用2M尿素溶解后的沉淀、上清；3-4.包涵體用4M尿素溶解后的沉淀、上清;5-6.包涵體用5M尿素溶解后的沉淀、上清;7-8.為包涵體用6M尿素溶解后的沉淀、上清;9-10.為包涵體用8M尿素溶解后的沉淀、上清Fig.5 SDS-PAGE analysis after inclusion body resolve withdifferent contents of urea

1-2.Deposition and supernatant of inclusion body dealt with 2M urea;3-4.Deposition and supernatant of inclusion body dealt with 4M urea; 5-6.Deposition and supernatant of inclusion body dealt with 5M urea;7-8.Deposition and supernatant of inclusion body dealt with 6M urea; 9-10.Deposition and supernatant of inclusion body dealt with 8M urea

圖6 重組蛋白純化復性SDS-PAGE分析M.蛋白分子質量標準;1.表達產物對照;2.純化后蛋白;3.復性后蛋白Fig.6 SDS-PAGE analysis of purified protein andrenaturated protein

M.Protein molecular weight Marker;1.Total protein in recombinantE.coli;2.Purified protein;3.Renaturated protein

圖7 重組蛋白的Western blot活性鑒定1.純化蛋白與陽性血清作用;2.pET30a表達菌與陽性血清作用;3.純化蛋白與陰性血清作用; 4.pET30a表達菌與陰性血清作用Fig.7 Western blot of expressed products

1.Purified protein react with positive serum;2.Control of pET30a with positive serum.3.Purified protein react with negative serum;4.Control of pET30a with negative serum.

3 討 論

目前針對DEV特異性抗體的檢測方法有多種，其中病毒中和試驗(VN)是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)指定的DEV特異抗體的檢測方法，但是VN操作繁瑣，判定結果時間長，不適于急性病程以及大批樣本的檢測。另外也有間接免疫熒光(IFA)的報道，但是IFA具有結果判定的客觀性不足，技術程序較為復雜，染色具有非特異性，需要在專業(yè)實驗室內進行等缺點。而酶聯免疫吸附試驗(ELISA)自1971年Engval等建立以來，就以其簡便、快速、敏感、安全、可自動化、使用儀器少等優(yōu)點而被廣泛應用于畜禽傳染病抗原抗體的檢測。齊雪峰等[13]、閆虹光等[14]建立了檢測鴨腸炎病毒的間接ELISA方法與試劑盒，但因使用全病毒作為包被抗原，在制備有效的診斷抗原方面存在一定的困難，由于受病毒培養(yǎng)和純化等方面的技術限制，全病毒抗原純度有限，制備過程繁瑣以及缺少標準化，一定程度上影響了檢測的準確性，故基因工程技術表達的人工抗原逐步成為研究的熱點。囊膜糖蛋白gB是皰疹病毒科中主要的免疫原性蛋白，目前皰疹病毒的疫苗與診斷試劑大多數是針對gB蛋白的抗原表位，王文潔等[12]將DNAStar分析與篩選出鴨病毒性腸炎病毒gB基因的兩段主要抗原區(qū)域進行了原核表達，Western-bloting與免疫鼠血清ELISA抗體檢測結果表明表達的gB重組蛋白具有良好的免疫原性， 馬波等[15]隨后克隆了gB胞漿區(qū)基因片段，經原核系統(tǒng)表達后，Western-blot檢測表明融合蛋白具有良好的反應活性。本研究用DNAstar生物學軟件對DEV gB基因的抗原區(qū)、親水區(qū)及表面展示概率進行分析，選擇主要抗原區(qū)域進行了原核表達，western blot檢測表明重組蛋白具有良好的反應活性，以該蛋白作為診斷抗原，初步建立了檢測鴨腸炎病毒抗體的間接ELISA診斷方法，該方法與病毒中和試驗的符合率達97.67 %，具有良好的特異性、敏感性。針對目前所建立的檢測DEV血清抗體的ELISA方法存在的諸多問題，探索建立靈敏特異具實用價值的DEV ELISA檢測方法對我國DEV的控制消滅及流行病學調查具有重要的意義。這也正是本文所進行的探索性試驗，我們利用大腸桿菌表達的gB蛋白片段作為DEV診斷抗原初步建立了間接ELISA檢測方法，為進一步開發(fā)商品化試劑盒奠定了基礎。

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