田秀娥，藺曉舟

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

獺兔是一種典型的毛皮用兔，因其毛皮酷似珍貴的水獺，因而被群眾稱為獺兔或天鵝絨兔。在規(guī)?；墨H兔飼養(yǎng)中，為了克服其季節(jié)性繁殖的限制，提高優(yōu)良種公兔的使用年限，利用冷凍精液進(jìn)行人工授精無疑是達(dá)到這一目的的有效途徑。在精液的冷凍保存過程中，影響保存效果的因素較多，其中平衡時(shí)間為影響因素之一。

在家畜精液冷凍保存中，精液經(jīng)稀釋后緩慢降溫至4～5 ℃，并在此環(huán)境中放置一定時(shí)間，以增強(qiáng)精子的耐凍性，這個(gè)處理過程叫做平衡，是精液冷凍保存過程中必不可少的環(huán)節(jié)之一。平衡時(shí)間的長(zhǎng)短在不同動(dòng)物和不同國(guó)度也不盡一致，與動(dòng)物種類、稀釋液種類、冷凍速度、冷凍方法等因素相關(guān)[1-3]。辛國(guó)省[4]、鄭筱峰等[5]報(bào)道認(rèn)為，藏獒精液冷凍保存時(shí)平衡最佳時(shí)間為15～20 min；姜興剛[6]研究表明，豬精液冷凍保存的平衡最佳時(shí)間為60 min；有關(guān)牛精液冷凍保存的平衡最佳時(shí)間不同研究結(jié)果差異較大，從3 h[7]到4～5 h[8]，再到7.5 h[9]不等。關(guān)于家兔精液冷凍保存時(shí)最佳平衡時(shí)間，楊素芳[10]認(rèn)為平衡時(shí)間以30～60 min較好，但羅光彬等[11]認(rèn)為最佳平衡時(shí)間為90 min。另外，趙建軍等[12]研究表明，平衡時(shí)間并不影響精液冷凍保存效果。

因此，關(guān)于平衡時(shí)間對(duì)動(dòng)物精液冷凍保存效果的研究結(jié)果不僅不同物種間的差異較大，而且對(duì)于同一物種的研究結(jié)論也不盡相同。由于兔凍精在多產(chǎn)多育方面效果比鮮精差[13]，因而兔的人工授精多用鮮精或是短期儲(chǔ)存的精液，其結(jié)果是極大限制了優(yōu)秀公兔種用價(jià)值的利用。為了大力推廣使用兔冷凍精液的人工授精，充分提高種公兔的利用率，制作品質(zhì)優(yōu)良的獺兔冷凍精液是其必不可少的前提，而平衡時(shí)間的長(zhǎng)短是影響精液冷凍保存效果的因素之一。試驗(yàn)將采精的獺兔鮮精混合精液經(jīng)精液品質(zhì)檢查、稀釋后平均分為4份，分別平衡30、60、90、120 min后分裝、冷凍，解凍后檢查精液品質(zhì)，探究不同平衡時(shí)間對(duì)獺兔精液冷凍解凍后品質(zhì)變化的影響，以篩選出最佳的平衡時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)用獺兔為身體健康的成年公兔5只，采用單籠飼養(yǎng)，定時(shí)、定量飼喂全價(jià)飼料，自由飲水。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 兔用假陰道、顯微鏡(13395H2X，Leica Microsystems Inc，USA)、恒溫水浴鍋(精宏)、座式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋、冰箱(海爾BCD-213G)。

1.1.3 主要試劑藥品 Tris(1kg, SIGMA,批號(hào)：1001318282)；檸檬酸(500 g，四川西隴化工有限公司，批號(hào)：100705)；丙三醇(500 mL，西安三浦精細(xì)化工廠，批號(hào)：20091122)；葡萄糖(500 g，天津市登豐化學(xué)品有限公司，批號(hào)：20100618)。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)用基礎(chǔ)液及稀釋液的配制 按Tris 30.3 g/L，檸檬酸16.8 g/L，葡萄糖12.5 g/L配制好基礎(chǔ)液，消毒滅菌后置5℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采精前取出基礎(chǔ)液，分別加入卵黃(200 mL/L)，青霉素(1.0×106IU/L)，鏈霉素(1.0×106IU/L)及8%的甘油，混勻后預(yù)熱至30 ℃用于稀釋品質(zhì)合格的精液。

1.2.2 精液采集、稀釋、冷凍與解凍 用自制兔用假陰道采集5只公獺兔的精液并混合，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室然后檢查精液品質(zhì)。當(dāng)色澤乳白、無異味、密度適中、pH在7.0～7.5之間、活率在80%以上，則用預(yù)熱的稀釋液以1∶1的比例稀釋原精，輕搖混勻后均分成4份，移入4只已編號(hào)的試管內(nèi)。用16層以上紗布包裹，置于5 ℃冰箱中緩慢降溫平衡，分別平衡30 min、60 min、90 min、120 min，即試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組。平衡后裝入0.25 mL的細(xì)管中，封口后于距液氮表面3 cm處熏蒸8 min，移至液氮罐中冷凍保存。解凍時(shí)，將從液氮罐中取出的細(xì)管立即放入40 ℃恒溫水浴鍋中，約3秒后取出立即檢查精液品質(zhì)，每個(gè)細(xì)管每個(gè)指標(biāo)均檢測(cè)3～4次，將其平均數(shù)作為一次重復(fù)，試驗(yàn)共進(jìn)行了3次重復(fù)。

1.2.3 精液品質(zhì)檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.2.3.1 精子活率 采用伊紅試劑染色法測(cè)定，每次計(jì)數(shù)400個(gè)精子。計(jì)算公式：

活率=未著色精子數(shù)/總精子數(shù)；

1.2.3.2 畸形率 采用伊紅試劑以1∶1的比例對(duì)解凍后的精液進(jìn)行染色，并制備成抹片，每次計(jì)數(shù)400個(gè)精子。計(jì)算公式：

畸形率=畸形精子數(shù)/計(jì)數(shù)精子總數(shù)×100%

1.2.3.3 精子質(zhì)膜完整率 采用低滲膨脹試驗(yàn)測(cè)定精子質(zhì)膜完整率。計(jì)算公式：

質(zhì)膜完整率=彎尾精子數(shù)/計(jì)數(shù)總精子數(shù)×100%

1.2.3.4 精子頂體完整率 采用姬姆薩染色法測(cè)定精子的頂體完整率。計(jì)算公式：

精子頂體完整率=頂體完整型精子數(shù)/計(jì)數(shù)總精子數(shù)×100%

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法

試驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS17.0中one way-AVOVA進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

不同平衡時(shí)間對(duì)獺兔精液冷凍保存后精液品質(zhì)的影響見表1、圖1。從表1可知，平衡60 min的精子凍后活率顯著高于30 min、90 min及120 min(P<0.05)；平衡60 min的精子畸形率顯著低于30 min(P<0.05)，但與其他組無顯著差異(P>0.05)；平衡30 min、60 min的精子質(zhì)膜完整率顯著高于120 min(P<0.05)，與90 min差異不顯著(P>0.05)；組間精子頂體完整率差異均不顯著(P>0.05)。

從圖1可看出，隨著平衡時(shí)間的延長(zhǎng)，精子活率呈先增長(zhǎng)、后下降的趨勢(shì)，在平衡時(shí)間為60 min時(shí)的活率達(dá)到最高；精子的畸形率呈先降低趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，在平衡時(shí)間為60 min時(shí)的精子畸形率最低，其他幾組畸形率均高于平均60 min組，表明平衡時(shí)間過短或過長(zhǎng)都會(huì)使獺兔冷凍精液中畸形精子數(shù)上升，從而使精子的受精能力下降；精子的質(zhì)膜完整率總體呈下降趨勢(shì)，平衡30 min至60 min階段下降較緩慢，超過60 min后下降較快；精子的頂體完整率隨平衡時(shí)間的延長(zhǎng)，呈先緩慢下降再趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，總體上受平衡時(shí)間的影響較小。表明這兩個(gè)指標(biāo)受平衡時(shí)間的影響較小，在精液品質(zhì)分析選取指標(biāo)時(shí)可以酌情取舍。

表1 不同平衡時(shí)間對(duì)冷凍精液品質(zhì)的影響Table 1 Effects of equilibrium time on the quality of cryopreservation spermatozoa

注：同列不同小字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或未標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)。

Note: Values with different letters within columns are significantly different(P<0.05)，those with the same letters or without a letters are not significant(P>0.05).

圖1 不同平衡時(shí)間下精液品質(zhì)的變化Fig.1 The variation of sperm motility rate under different equilibrium time

3 討 論

關(guān)于平衡時(shí)間對(duì)冷凍精子保存效果的影響，不同的研究人員選取的測(cè)定指標(biāo)不同，但均涉及了精子活率，如藏獒[4]、豬[6]、牛[7-8]等。鄭筱峰等[5]在對(duì)藏獒精子冷凍保存的最佳平衡時(shí)間探究時(shí)，選擇了活率、頂體完整率2個(gè)指標(biāo)，不同平衡時(shí)間時(shí)這兩個(gè)指標(biāo)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明，隨平衡時(shí)間的延長(zhǎng)精子頂體完整率呈下降趨勢(shì)，但未達(dá)顯著水平，而活率在各組間差異較大，可能與物種及平衡時(shí)間的設(shè)置不同有關(guān)；安立龍等[14]在研究雞的精液冷凍中，分析了活率和畸形率2個(gè)指標(biāo)，根據(jù)所選的二個(gè)指標(biāo)測(cè)得的最佳平衡時(shí)間與本研究結(jié)果一致；劉玉等[9]探究平衡時(shí)間對(duì)種公牛精子冷凍保存效果的影響時(shí)，測(cè)定了活率、畸形率、頂體完整率3個(gè)指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)畸形率受平衡時(shí)間影響不大，但隨著平衡時(shí)間的延長(zhǎng)，活率先上升后下降，頂體完整率下降。除畸形率外，其它2個(gè)指標(biāo)與本研究結(jié)果基本一致。盧晟盛等[15]通過對(duì)活率、畸形率、質(zhì)膜完整率、頂體完整率四項(xiàng)指標(biāo)的綜合評(píng)定，以確定食蟹猴精液最佳平衡時(shí)間。結(jié)果除活率外，其他指標(biāo)隨平衡時(shí)間變化(30 min、60 min、90 min、120 min)均不顯著。

雖然上述研究人員的研究結(jié)果與本研究結(jié)果相比有的一致，有的不一致，但分析上述各研究人員的研究結(jié)果后不難發(fā)現(xiàn)，活率是每個(gè)試驗(yàn)研究中均涉及的指標(biāo)，也是能反映各不同物種凍精品質(zhì)變化的較好指標(biāo)。充分反映出活率是評(píng)定精液品質(zhì)最基本，也是最重要的指標(biāo)之一，其他指標(biāo)如畸形率、頂體完整率、質(zhì)膜完整率的測(cè)定結(jié)果對(duì)精液品質(zhì)的關(guān)系在各不同試驗(yàn)研究中結(jié)果不一，結(jié)合本試驗(yàn)的探究結(jié)果，認(rèn)為除活率和畸形率外，其他指標(biāo)不能及時(shí)靈敏地反映出精液品質(zhì)變化情況。在探究平衡時(shí)間對(duì)精液冷凍效果時(shí)，為了減少試驗(yàn)工作量，僅測(cè)定活率這一個(gè)指標(biāo)即可較為客觀、準(zhǔn)確地精液品質(zhì)的變化情況。

楊素芳等[10]以家兔為研究對(duì)象，將其精液在4 ℃下平衡30、60、120、180 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在30～60 mn之間，解凍后精子活率差異并不顯著。隨后陳玉等[16]將哈白兔精液置5 ℃冰箱平衡30、60、90、120 min，結(jié)果平衡30、60 min解凍后活率較好，但差異不顯著，而平衡90、120 min效果很差，與本研究平衡30 min與60 min時(shí)凍后活率差異顯著的結(jié)果不一致，其原因可能是兔品種不同、稀釋液組成不同、稀釋液中抗凍保護(hù)劑種類及添加劑量不同等所致。羅光彬等[11]將獺兔精液稀釋后置于5 ℃的冰箱內(nèi)分別平衡90、120、150、180 min，解凍后精子活率90 min組最高，其次120 min組、150 min組，180 min組最低，但各組間差異顯著，認(rèn)為90 min為最佳平衡時(shí)間，但作者并未繼續(xù)探討90 min以下平衡時(shí)間對(duì)獺兔精液冷凍保存效果的影響。在本研究中，平衡90 min以上的精液活率也呈下降趨勢(shì)，與此研究結(jié)果基本一致。

精液經(jīng)含有甘油的稀釋液稀釋后，需在4～5 ℃下靜置一段時(shí)間，使甘油充分滲透進(jìn)精子內(nèi)，以達(dá)到抗凍保護(hù)作用，謂之平衡。精子經(jīng)適當(dāng)?shù)蜏仄胶夂罂稍鰪?qiáng)其耐凍能力，減輕在冷凍過程中冰晶化對(duì)精子的損害。雖然關(guān)于平衡的機(jī)理至今尚不明確[1]，但若平衡時(shí)間過短或過長(zhǎng)，都會(huì)降低精子的抗凍能力，提高在冷凍過程中冰晶化對(duì)精子的損害，從而最終導(dǎo)致冷凍解凍后精液品質(zhì)的下降，上述試驗(yàn)及本研究結(jié)果均驗(yàn)證了這一結(jié)論。

4 小 結(jié)

活率是評(píng)定平衡時(shí)間對(duì)精液冷凍保存效果影響的較為客觀且準(zhǔn)確的指標(biāo)，獺兔精液冷凍保存時(shí)合適的平衡時(shí)間為60 min。

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