徐 艷，王 軍

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，江蘇徐州 221002)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 新生7d齡SD大鼠，體質(zhì)量12～18g，均由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要儀器 8%O2/92%N2混合氣體(上海特種氣體廠);常壓缺氧艙(上海市兒科研究所);手動(dòng)勻漿器;Western blot所用的儀器設(shè)備(徐州醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供);Eppendor臺(tái)式超速冷凍離心機(jī)(德國(guó)eppendo公司);－80℃超低溫冰箱(Thermo electron corporation);CK30倒置相差顯微鏡(日本Olympus);可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);PCR擴(kuò)增儀(MJ Research，InC);Thermo酶標(biāo)儀(上海熱電儀器有限公司);凝膠圖像分析處理系統(tǒng)(Labworks)(UVP Inc.Upland，CA，USA)。

1.1.3 主要試劑 胞核提取試劑盒(北京五洲元業(yè)生物有限公司);AIF一抗(Santa cruz公司)、兔抗羊二抗(北京中杉生物技術(shù)有限公司);NBT/BCIP顯色劑(碧云天生物公司);Marker(Santa cruz公司);AIF及β-actin引物合成、總RNA抽提試劑盒(Trizol法)、AMV一步法RT-PCR試劑盒(上海捷瑞生物技術(shù)有限公司);Tunel凋亡試劑盒(武漢博士德公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備 參照 Rice法［1］制作HIBD模型和假手術(shù)模型。將新生7d齡SD大鼠用無(wú)水乙醚吸入麻醉(0.5～1.0min)后，取仰臥位，四肢固定于手術(shù)板上，頸正中線切開(kāi)皮膚，游離右側(cè)頸總動(dòng)脈絲線結(jié)扎，并縫合切口造成缺血?；馗C休息2h。再置入一體積為2000ml、底部鋪有CO2吸收劑鈉石灰、與混合氣體相連的密閉有機(jī)玻璃箱內(nèi)，該容器置于37℃水浴中。以1～2L/min的速度輸入含8%氧、92%氮?dú)獾幕旌蠚怏w，持續(xù)2h，造成缺氧。假手術(shù)組只做頸部切開(kāi)和右頸總動(dòng)脈分離術(shù)，不結(jié)扎，縫合切口后呼吸正?？諝?。

1.2.2 分組及給藥方法 新生7d的SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(S)、生理鹽水對(duì)照組(C)和參附治療組(SF)。生理鹽水對(duì)照組HI后立即腹腔注射生理鹽水10ml/kg，每日1次，連續(xù)注射3d;參附治療組HI后立即腹腔注射參附注射液，劑量及用法同生理鹽水對(duì)照組。每組按術(shù)后觀察時(shí)間點(diǎn)不同進(jìn)一步分為 3h、6h、12h、24h、3d、7d 6 個(gè)亞組，每個(gè)亞組8只。

1.2.3 免疫印跡法檢測(cè)胞核中AIF蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化 (1)亞細(xì)胞器的分離:各組新生大鼠在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)斷頭取腦，稱取患側(cè)大腦皮層新鮮腦組織100mg左右，參照胞核提取試劑盒(N1201)說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。將提取好的胞核貯存在－80℃冰箱中。采用改良的lowry法測(cè)胞核的蛋白濃度，牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白;(2)Western blot法測(cè)胞核中的AIF 制備10%分離膠和5%濃縮膠，每個(gè)上樣孔的上樣量均為50μg;電泳、半干轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)到NC膜上，脫脂奶粉封閉1h，將NC膜孵育在AIF(sc-9416，1∶300)，4℃過(guò)夜。將 NC 膜在兔抗羊二抗(1∶1000)中孵育2h，NBT/BCIP顯色，用 Image J軟件分析系統(tǒng)分析條帶光密度值(OD)。組蛋白H1(Histone-H1)作為內(nèi)部參照，用每個(gè)樣本OD值與Histone-H1OD值的比值作為最后結(jié)果。

1.2.4 用RT-PCR法檢測(cè)腦皮層組織AIF mRNA的水平 各組新生大鼠在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)斷頭取腦，稱取100 mg患側(cè)大腦皮層組織置入5ml無(wú)核酶的EP管中，放入－80℃冰箱中貯存?zhèn)溆?用Trizol法從組織中提取總的mRNA;一步法行RT-PCR，步驟參照說(shuō)明書(shū);2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析數(shù)據(jù)。AIF上游引物:5’-CGTCCC TTTCCTGCTGATTG-3’;下游引物:5’-TTCCATTCC ACTGTCTGAACTG-3’;目的基因長(zhǎng)度:203bp，Tm:54.4℃;β-actin 上游引物:5’-CCATTGAACACG GGCATTG-3’;下游引物:5’-ACGACCAGAGGC ATACAG-3’;目的基因長(zhǎng)度:252bp，Tm:55℃。

1.2.5 原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)腦皮層組織的凋亡細(xì)胞 按上述時(shí)間點(diǎn)，動(dòng)物在乙醚麻醉下開(kāi)胸，經(jīng)心尖搏動(dòng)處插管，用生理鹽水20 ml沖洗血流，繼之灌入4%多聚甲醛(0.1mol/L PB，pH 7.4)約20ml，灌畢即取右腦，沿視交叉前緣做2mm厚的冠狀切片，放入4%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋后行6μm連續(xù)切片，進(jìn)行Tunel染色，Tunel試劑盒(MK1022)購(gòu)自武漢博士德公司，步驟參照說(shuō)明書(shū)。光鏡下，胞核中有紫藍(lán)色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。每張切片以40×10倍光鏡下計(jì)數(shù)10個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，將10個(gè)視野計(jì)數(shù)的平均值作為統(tǒng)計(jì)參數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，計(jì)量資料相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)間點(diǎn)各組新生大鼠AIF在胞核中的變化

表1圖1顯示，假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)均沒(méi)有AIF表達(dá);生理鹽水對(duì)照組在HI后3h即有少量的AIF表達(dá)，隨著HI時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，24h達(dá)到高峰，隨后開(kāi)始下降，7d時(shí)仍有較高的表達(dá);參附治療組在HI后3h、6h、12h與生理鹽水對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，24h開(kāi)始下降，到7d時(shí)與生理鹽水對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 胞核各組不同時(shí)間點(diǎn)AIF與Histone H1比值的比較(±s，n=8)

表1 胞核各組不同時(shí)間點(diǎn)AIF與Histone H1比值的比較(±s，n=8)

注:與S組比較:※P＜0.01，SF組與C組比較:△P＜0.01

3h 6h 12h 24h 3d 7d S 000000 0.143 0.112 0.063 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 C 0.335±0.019※ 0.723±0.005※ 1.058±0.010※ 1.238±0.040※ 0.882±0.016※ 0.627±0.015※SF 0.351±0.022※ 0.716±0.009※ 1.049±0.009※ 0.872±0.017※△ 0.635±0.017※△ 0.410±0.007※△t 1.553 1.696 2.016 23.752 30.389 36.636 P

2.2 各時(shí)間點(diǎn)腦皮層組織細(xì)胞中AIF mRNA的水平

表2圖2顯示，假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)均有少量表達(dá);生理鹽水對(duì)照組在HI后3h開(kāi)始增加，24h達(dá)到高峰隨后下降，7d時(shí)仍高于假手術(shù)組(P＜0.05);參附治療組在HI后各時(shí)間點(diǎn)AIF mRNA的水平均低于生理鹽水對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)AIF mRNA與β-actin mRNA比值的比較(±s，n=8)

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)AIF mRNA與β-actin mRNA比值的比較(±s，n=8)

注:與S組比較:※P＜0.01，SF組與C組比較:△P＜0.01

＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01±0.026 0.296±0.026 0.287±0.032 C 0.684±0.010※ 0.757±0.026※ 1.039±0.024※ 1.549±0.045※ 0.878±0.026※ 0.824±0.013※SF 0.450±0.022※△ 0.601±0.027※△ 0.917±0.039※△ 1.140±0.073※△ 0.607±0.017※△ 0.353±0.013※△F 484.137 443.835 1099.162 918.262 935.702 1108.996 P 3h 6h 12h 24h 3d 7d S 0.278±0.031 0.293±0.029 0.291±0.024 0.291

表3 各組各時(shí)間點(diǎn)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(個(gè)/HP)(±s，n=8)

表3 各組各時(shí)間點(diǎn)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(個(gè)/HP)(±s，n=8)

注:與S組比較:※P＜0.01，SF組與C組比較:△P＜0.01

＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01±1.2 C 5.5±1.0※ 14.5±2.6※ 37.7±1.9※ 60.7±2.2※ 25.2±2.1※ 6.7±1.8※SF 5.8±1.2※ 14.3±2.3※ 36.2±1.9※ 45.7±2.1※△ 11.2±1.7※△ 1.8±0.8△F 29.4 77.6 1207.5 1814.4 300.3 32.4 P 3h 6h 12h 24h 3d 7d S 1.5±1.0 1.3±1.0 1.3±0.8 1.2±0.8 1.3±1.0 1.2

圖1 各組不同時(shí)間點(diǎn)胞核內(nèi)AIF的免疫印記條帶

圖2 各組不同時(shí)間點(diǎn)AIF mRNA電泳圖

2.3 各時(shí)間點(diǎn)腦皮層組織細(xì)胞的凋亡

表3顯示，光鏡形態(tài)學(xué)檢測(cè)各組各時(shí)間點(diǎn)均可見(jiàn)典型凋亡神經(jīng)細(xì)胞，表現(xiàn)為染色質(zhì)結(jié)緊、細(xì)胞皺縮，核固縮碎片，胞漿深染、胞漿空泡形成，見(jiàn)圓形凋亡小體。凋亡細(xì)胞周圍無(wú)炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為單個(gè)細(xì)胞缺失。同時(shí)有細(xì)胞壞死，有較為清楚的壞死灶。S組各時(shí)間點(diǎn)腦皮質(zhì)見(jiàn)個(gè)別的凋亡細(xì)胞;HIBD后C組和SF組3h凋亡細(xì)胞數(shù)開(kāi)始增加，24h達(dá)到高峰后開(kāi)始下降，7d時(shí)仍可見(jiàn)凋亡細(xì)胞多于S組(P＜0.01)。SF組腦細(xì)胞凋亡數(shù)在24h、3d、7d均低于C組 (P＜0.01)。

3 討論

參附注射液是由中醫(yī)治療厥脫證(休克)的著名古方參附湯加工提煉而成，為紅參和黑附片的提取物，主要成分為人參皂苷(Rb1)和烏頭類生物堿，具有益氣溫陽(yáng)之功效。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，參附注射液具有多種藥理作用和神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制為抑制細(xì)胞能量代謝障礙，清除氧自由基，減輕鈣超載，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，減輕炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡等［2］。既往研究發(fā)現(xiàn)，參附注射液可以明顯降低細(xì)胞凋亡指數(shù)，降低細(xì)胞凋亡的基因，包括凋亡誘導(dǎo)基因如Bak、Bax、Fas和凋亡抑制基因如 Bcl-2、Bcl-XL等的表達(dá)，有效防止細(xì)胞凋亡的末端效應(yīng)Caspase的激活，從而能明顯抑制細(xì)胞凋亡［3～7］。但參附注射液是否對(duì)AIF具有抑制作用，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor，AIF)是一種57kDa的黃素蛋白，存在于線粒體內(nèi)外膜間，具有維持線粒體結(jié)構(gòu)和促凋亡作用。一旦細(xì)胞遇到凋亡刺激，AIF從線粒體釋放轉(zhuǎn)入細(xì)胞漿或核內(nèi)，引起染色質(zhì)的凝聚和DNA的斷裂。Zhu C等［8］研究AIF基因變異鼠缺氧缺血后腦梗死面積與野生鼠比較，雄鼠下降53%，雌鼠下降43%。Culmsee C等［9］發(fā)現(xiàn)，AIF缺乏對(duì)未成熟大鼠腦缺血后的保護(hù)作用超過(guò)50%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)成年大鼠腦缺血的保護(hù)作用。

李峰等［10］通過(guò)用不同劑量的參附注射液腹腔注入SD大鼠，用以研究其對(duì)顱腦損傷的保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同劑量間無(wú)劑量效應(yīng)關(guān)系，故本實(shí)驗(yàn)選擇中等劑量的參附注射液(10ml/kg)。本研究顯示，假手術(shù)組僅有少量的AIFmRNA表達(dá);生理鹽水對(duì)照組在HI后3h AIF mRNA表達(dá)開(kāi)始增加，24h達(dá)到高峰隨后下降，提示在腦缺氧缺血這種凋亡信號(hào)刺激下，AIF的轉(zhuǎn)錄開(kāi)始活躍，且AIF mRNA隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化與HI后神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生規(guī)律吻合，提示AIF基因轉(zhuǎn)錄參與細(xì)胞的凋亡，這與張麗等［11］研究局灶性大鼠腦缺血再灌注損傷AIFmRNA表達(dá)變化的結(jié)果相似。參附治療組在HI后每一時(shí)間點(diǎn)AIFmRNA表達(dá)均明顯低于對(duì)照組，提示參附注射液能夠在轉(zhuǎn)錄水平上抑制AIF的表達(dá)，從而抑制凋亡起到腦保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組胞核內(nèi)沒(méi)有AIF的表達(dá)，提示正常情況下胞核內(nèi)沒(méi)有或有極少量的AIF表達(dá);生理鹽水對(duì)照組在HI后3h AIF核轉(zhuǎn)位開(kāi)始增加，24h達(dá)到高峰隨后下降。這與腦皮層凋亡細(xì)胞數(shù)的變化趨勢(shì)一致，提示AIF核轉(zhuǎn)位參與了細(xì)胞的凋亡。華正宇等［12］用免疫組化方法研究局灶性大鼠腦缺血再灌注損傷AIF的表達(dá)，也得出與本研究相似的結(jié)果。在HIBD后3h、6h、12h胞核中的AIF表達(dá)較對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，24h、3d、7d胞核中的AIF表達(dá)較對(duì)照組明顯減少。我們同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，參附治療組凋亡細(xì)胞數(shù)在24h后也明顯少于對(duì)照組，提示參附注射液可以通過(guò)抑制AIF核轉(zhuǎn)位來(lái)抑制凋亡。參附注射液對(duì)蛋白和基因抑制作用的時(shí)間點(diǎn)不同，考慮可能與參附注射液透過(guò)血腦屏障需要一定的時(shí)間才能發(fā)揮藥理作用有關(guān)。

總之，通過(guò)本研究進(jìn)一步闡明了參附注射液抑制缺氧缺血性腦損傷新生大鼠凋亡的機(jī)制，參附注射液不僅可以抑制轉(zhuǎn)錄水平的AIF，而且也可以抑制AIF的核轉(zhuǎn)位，從而抑制凋亡的發(fā)生，發(fā)揮腦損傷的保護(hù)作用，為參附注射液在新生兒缺氧缺血性腦病的臨床應(yīng)用提供了更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

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