王麗娟，王 勇，楊 婕，儲燕平，張書靖

(1.天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134;2.天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院制藥系，天津 300134)

獨一味 Lamiophloms rotate(Benth.)Kudo為唇形科無莖多年生草本植物，以根及根狀莖入藥，是藏、蒙、納西等民族民間常用草藥。研究表明，獨一味具有止血鎮(zhèn)痛、抗菌、改善學習記憶功能以及預(yù)防胃潰瘍發(fā)生等諸多方面的作用，臨床主要用于骨外傷、術(shù)后及婦科等多種疾病的鎮(zhèn)痛、止血、消炎等［1～6］。文獻報道，獨一味巴布膏對免疫功能有調(diào)節(jié)作用［7］，但其對免疫性關(guān)節(jié)炎的影響至今未見報道。佐劑誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎(adjuvant-induced arthritis，AIA)是一種免疫性炎癥模型，是研究治療風濕和類風濕關(guān)節(jié)炎藥物的理想病理模型，常用于篩選抗炎免疫藥物。本實驗觀察了獨一味對完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的大鼠類風濕關(guān)節(jié)炎的防治作用，為獨一味臨床用途的進一步開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 藥物與試劑

獨一味購自青海西寧，實驗室提取并配制成所需濃度;醋酸潑尼松片，天津力生制藥股份有限公司(批號1006044)，研細用生理鹽水配制成混懸液備用;完全弗氏佐劑10ml，美國Sigma公司。

1.2 動物

Wistar大鼠14～16周齡，體質(zhì)量160g～210g，雌雄兼用，由天津市實驗動物中心提供(合格證號為SCXK(津)2010-0002)。

1.3 主要儀器

PV-200足跖容積儀，成都泰盟科技有限公司;UV-7504單束光紫外-可見分光光度計，上海欣茂儀器有限公司;HZS-H水浴振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

2 方法

2.1 獨一味水提取物的制備

獨一味粉碎并干燥，稱量后加水浸泡并煎煮3次，每次1 h，第1次加水量為11倍，第2、3次加水量為8倍，合并煎液室溫下冷卻、過濾，將濾液濃縮至生藥 1g·ml－1，置于冰箱中備用。

2.2 獨一味醇提取物的制備

獨一味粉碎并干燥，稱取適量并加入20倍量60%乙醇，回流提取25min，室溫下冷卻、過濾，將濾液濃縮至生藥1g·ml－1，置于冰箱中備用。

2.3 預(yù)防性給藥觀察獨一味對關(guān)節(jié)炎原發(fā)病變的影響

Wistar大鼠50只，體質(zhì)量160g～210g，雌雄各半，隨機分成5組，每組10只。即1組:生理鹽水;2組:模型;3組:醋酸潑尼松(0.5g·kg－1);4組:獨一味水提取物(生藥1.0g·kg－1);5組，獨一味醇提取物(1.0g生藥·kg－1)。各組均灌胃給藥，容量為10ml·kg－1，1 組和2 組灌胃等容量生理鹽水，每日 1次，連續(xù)22d。于給藥第4天制作免疫性炎癥模型。每鼠右足跖消毒后，皮下注射完全弗氏佐劑0.1ml進行致炎，1組注射等容量生理鹽水。在致炎前、致炎后第18、42、66、8天和第19天分別測各鼠右足容積，通過比較大鼠致炎側(cè)足容積的變化，評價獨一味對佐劑性關(guān)節(jié)炎原發(fā)病變的影響［8］。

2.4 預(yù)防性給藥觀察獨一味對繼發(fā)病變影響

Wistar大鼠50只，體質(zhì)量160g～210g，雌雄各半，隨機分成5組，每組10只(分組情況同2.3)。由于遲發(fā)型超敏反應(yīng)所致的繼發(fā)性病變一般出現(xiàn)于致炎后10d左右，故各鼠右足跖消毒后皮下注射完全弗氏佐劑0.1ml進行致炎，1組注射等容量生理鹽水。于致炎后第6天各組灌胃給藥，容量為10 ml·kg－1，1組和2組灌胃等容量生理鹽水，每日1次，連續(xù)14 d。于致炎前、致炎后第11～14天和第19天分別測各鼠左足(致炎對側(cè))容積。致炎19d后，采用關(guān)節(jié)炎綜合評分法對關(guān)節(jié)炎的嚴重程度進行評價［9］。四肢及足關(guān)節(jié)評分標準:0分=正常，1分=僅皮膚紅，2分=皮膚紅+輕腫，3分=嚴重腫，4分=關(guān)節(jié)變形、強直。每只鼠的關(guān)節(jié)炎總分數(shù)為四足分數(shù)之和。通過比較各組大鼠左足容積和關(guān)節(jié)炎綜合評分，評價獨一味的抗風濕作用。

2.5 治療性給藥觀察獨一味對繼發(fā)病變的作用

Wistar大鼠體質(zhì)量160g～210g，雌雄各半，隨機分成5組，每組8只(分組情況同2.3)。各鼠右足跖消毒后皮下注射完全弗氏佐劑0.1ml進行致炎，1組注射等容量生理鹽水。于致炎后第19天(繼發(fā)病變已經(jīng)形成)各組灌胃給藥，容量為10 ml·kg－1，1組和2組灌胃等容量生理鹽水，每日1次，連續(xù)7 d。于致炎前、致炎后第11、14、19、22、25 天和第 30 天分別測各鼠左足(致炎對側(cè))容積。通過比較各組大鼠左足容積，評價獨一味對免疫性炎癥的治療作用［8］，同時對體質(zhì)量增長、胸腺指數(shù)、脾指數(shù)進行比較。

2.6 獨一味對大鼠炎癥組織前列腺素(PGE2)含量的影響

取健康合格大鼠30只，隨機分為5組，每組6只(分組情況同2.3)。各組灌胃給藥，1組和2組給予等容量生理鹽水，連續(xù)給藥7d。于末次給藥后1h，各鼠分別右后足足跖皮下注射1%角叉菜膠0.1ml，1組注射等容量生理鹽水。5h后處死大鼠，剪取右足(致炎側(cè))稱其質(zhì)量，沿中線縱向剖開，置于5ml生理鹽水中4℃浸泡過夜，離心浸泡液，取上清 0.15ml，加入 0.5mol·L－1氫氧化鉀-甲醇溶液1ml，置于50℃恒溫水浴中異構(gòu)化20min，加甲醇4ml。在278nm波長下測定光密度，以每克炎性組織中相應(yīng)的光密度值表示PGE2含量［10］。

2.7 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果與分析

3.1 獨一味對原發(fā)病變的預(yù)防作用

表1顯示，模型組大鼠致炎后右足腫脹逐漸明顯，42h腫脹達高峰，66h減輕，8d再度腫脹，之后腫脹減輕。與生理鹽水組比較，模型組大鼠右足(致炎側(cè)，原發(fā)病變)容積差異有統(tǒng)計學意義。與模型組比較，獨一味和潑尼松組大鼠右足腫脹明顯減輕(P＜0.05)，對原發(fā)病變具有顯著的消腫和抗炎作用。

表1 獨一味對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎原發(fā)病變的預(yù)防作用(±s，n=10)

表1 獨一味對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎原發(fā)病變的預(yù)防作用(±s，n=10)

注:與生理鹽水組比較:▲▲P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 致炎前右足容積/ml致炎后右足容積/ml 18h 42h 66h 8d 19d生 理 鹽 水 0.70±0.07 0.70±0.07 0.71±0.05 0.73±0.05 0.76±0.04 0.82±0.04模0.93±0.07 0.93±0.07 0.88±0.06型 0.71±0.06 1.06±0.08▲▲ 1.10±0.09▲▲ 0.96±0.09▲▲ 0.98±0.07▲▲ 0.94±0.07▲▲醋 酸 潑 尼 松 0.70±0.08 0.86±0.15＊＊ 0.97±0.07＊＊ 0.88±0.08* 0.91±0.08* 0.85±0.07*獨 一味水提取物 0.71±0.05 0.80±0.13＊＊ 0.96±0.04＊＊ 0.88±0.07* 0.90±0.06* 0.86±0.07*獨一味醇提取物 0.72±0.07 0.90±0.14＊＊ 0.99±0.06＊＊

3.2 獨一味對繼發(fā)病變的預(yù)防作用

獨一味對大鼠致炎后不同時間左足容積的影響。表2顯示，致炎10d后，模型組大鼠致炎對側(cè)足也發(fā)生了腫脹，并隨時間逐漸加重。致炎后19d腫脹明顯，與生理鹽水組比較，模型組大鼠的足容積差異有統(tǒng)計學意義。獨一味組和潑尼松組大鼠的左足容積較模型組明顯減小，表明腫脹減輕，且關(guān)節(jié)炎綜合評分與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義，說明獨一味對該繼發(fā)病變有明顯的抑制作用。

3.3 獨一味對繼發(fā)病變的治療作用

表3顯示，獨一味對大鼠致炎后不同時間致炎對側(cè)足(左足，繼發(fā)病變)容積的影響;表4顯示，獨一味對大鼠體質(zhì)量及胸腺指數(shù)、腎上腺指數(shù)的影響。

表3顯示，在繼發(fā)病變發(fā)生后，左足腫脹逐漸加重。至第19天與生理鹽水組比較，各組腫脹明顯(足容積差異有統(tǒng)計學意義)，隨時間推移腫脹持續(xù)。而經(jīng)藥物治療后的大鼠足腫脹明顯減輕，與模型組比較獨一味組和潑尼松組大鼠的足容積差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，表明獨一味和潑尼松對免疫性炎癥有一定的治療作用。表4顯示，模型組大鼠的體質(zhì)量增長較緩慢，但與生理鹽水組比較差異無統(tǒng)計學意義，各組的胸腺指數(shù)和腎上腺指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義。

表2 獨一味對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎繼發(fā)病變的預(yù)防作用(±s，n=10)

表2 獨一味對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎繼發(fā)病變的預(yù)防作用(±s，n=10)

注:與生理鹽水組比較:▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01;與模型組比較:*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01

組別 致炎前左足容積/ml致炎后左足容積/ml 關(guān)節(jié)炎綜合評分生 理 鹽 水 0.70±0.08 0.77±0.09 0.78±0.06 0.80±0.08 0.8 11d 12d 13d 14d 19d 1±0.07 0.83±0.05 0模型 0.69±0.05 0.83±0.07 0.86±0.05▲▲ 0.88±0.05▲ 0.90±0.07▲ 0.93±0.05▲▲ 10.5±1.8▲▲醋 酸 潑 尼 松 0.71±0.06 0.79±0.06 0.80±0.06* 0.82±0.06 0.84±0.05* 0.86±0.06* 6.1±1.2＊＊獨 一 味 水 提 物 0.71±0.05 0.77±0.08 0.81±0.06 0.83±0.06 0.83±0.06* 0.84±0.07* 6.7±1.3＊＊獨 一 味 醇 提 物 0.70±0.06 0.79±0.07 0.82±0.08 0.85±0.07 0.85±0.07 0.87±0.06* 6.3±1.5＊＊

表3 獨一味對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎繼發(fā)病變的治療作用(±s，n=8)

表3 獨一味對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎繼發(fā)病變的治療作用(±s，n=8)

注:與生理鹽水組比較:▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01;與模型組比較:*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01

組別 致炎前左足容積/ml致炎后左足容積25d 30d生 理 鹽 水 0.69±0.06 0.76±0.06 0.77±0.06 0.78±0.06 0.8/ml 11d 14d 19d(開始給藥)0±0.08 0.82±0.07模型 0.70±0.06 0.81±0.06 0.86±0.06▲▲ 0.92±0.07▲▲ 0.95±0.08▲▲ 0.98±0.07▲▲醋 酸 潑 尼 松 0.71±0.07 0.81±0.08 0.87±0.09▲ 0.93±0.11▲▲ 0.84±0.10* 0.84±0.10＊＊獨 一 味 水 提 物 0.71±0.06 0.80±0.08 0.86±0.09▲ 0.92±0.09▲▲ 0.84±0.08* 0.85±0.09＊＊獨 一 味 醇 提 物 0.71±0.07 0.80±0.08 0.87±0.08▲ 0.92±0.09▲▲ 0.85±0.08* 0.84±0.08＊＊

表4 獨一味提取物對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠體質(zhì)量增長及臟器指數(shù)的影響(±s，n=8)

表4 獨一味提取物對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠體質(zhì)量增長及臟器指數(shù)的影響(±s，n=8)

注:各組比較:均P＞0.05

組別 實驗前體質(zhì)量/g 致炎后19d體質(zhì)量/g 體質(zhì)量增長/% 胸腺指數(shù)/(mg·100g－1)腎上腺指數(shù)/(mg·100g－1)生 理 鹽 水 178.5±17.3 210.4±20.7 17.9 128.92±29.67 19.92±2.29 95±4.72模型 178.5±17.0 200.6±18.0 12.4 130.26±23.84 21.01±4.94醋 酸 潑 尼 松 178.8±16.6 204.7±16.3 14.4 134.48±32.21 20.90±5.44獨一味水提取物 179.0±17.6 208.2±19.7 16.3 128.54±16.97 20.59±4.63獨一味醇提取物 178.6±16.6 207.6±18.6 16.2 125.11±25.83 18.

3.4 獨一味對炎癥組織PGE2含量的影響

表5顯示，模型組大鼠炎癥組織內(nèi)的PGE2含量明顯增加，而潑尼松和獨一味組炎癥組織的PGE2含量雖較生理鹽水組增加，但明顯低于模型組，表明潑尼松和獨一味的抗炎作用與抑制炎性組織PGE2的釋放有關(guān)。

表5 獨一味對炎癥組織PGE2含量的影響(±s，n=6)

表5 獨一味對炎癥組織PGE2含量的影響(±s，n=6)

注:與生理鹽水組比較:▲0.01＜P＜0.05，▲▲P＜0.01;與模型組比較:＊＊ P ＜0.01

組別PGE2含量/光密度·每克炎癥組織－1生 理 鹽 水 組0.025±0.007模 型 組 0.054±0.006▲▲醋 酸 潑 尼 松 組 0.038±0.008▲＊＊獨 一 味 水 提 取 物 組 0.038±0.006▲＊＊獨 一 味 醇 提 取 物 組 0.033±0.008＊＊

4 討論

大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎是一種免疫性炎癥模型，其發(fā)病機制和病理表現(xiàn)與人類風濕關(guān)節(jié)炎相似，是評價防治類風濕關(guān)節(jié)炎的常用藥物模型之一［11～13］。佐劑性關(guān)節(jié)炎分原發(fā)性反應(yīng)期和繼發(fā)性反應(yīng)期，原發(fā)性病變表現(xiàn)為致炎局部的炎癥反應(yīng)，繼發(fā)性病變一般出現(xiàn)于致炎后10d左右，主要表現(xiàn)為多發(fā)性關(guān)節(jié)炎［8］。

該實驗中，模型組大鼠足部(右足)皮下注射完全弗氏佐劑后，致炎側(cè)足逐漸腫脹(原發(fā)病變)，18h腫脹達高峰，3d減輕，8d再度腫脹，表現(xiàn)為急性炎癥反應(yīng);注射對側(cè)足(左足)的病變(繼發(fā)病變)發(fā)生于10d后，表現(xiàn)為足部發(fā)紅、腫脹并逐漸加重，個別鼠足部變形，皮膚表面出現(xiàn)潰瘍;在致病后，大鼠精神萎靡、毛發(fā)失去光澤、多發(fā)關(guān)節(jié)腫脹并伴有活動障礙，體質(zhì)量增長緩慢，與文獻報道相似［8，14］。

潑尼松為腎上腺皮質(zhì)激素類藥物，具有抗炎和免疫抑制作用，臨床可用于治療風濕和類風濕關(guān)節(jié)炎。實驗中觀察到，潑尼松使大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎原發(fā)病變和繼發(fā)病變均有較明顯的減輕，臨床表現(xiàn)癥狀緩解，與其非特異性抗炎及免疫抑制作用有關(guān)。獨一味能抑制大鼠原發(fā)病變的足腫脹，減輕炎癥反應(yīng)，與以往的實驗結(jié)果一致［2］。獨一味預(yù)防給藥對繼發(fā)病變的形成也有較明顯的抑制作用，致炎19d后測得的足容積及炎癥綜合評分均與模型組差異有統(tǒng)計學意義，與潑尼松的效果相近;獨一味治療性給藥(致炎后第19天給藥)，于致炎后第25天和第30天測得的足容積與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義，說明獨一味對繼發(fā)病變有明顯治療效果。獨一味對急性炎癥和佐劑引起的遲發(fā)型超敏反應(yīng)均有較好的抑制作用，這與獨一味膠囊劑、片劑的臨床治療效果相吻合［15～17］，實驗結(jié)果為獨一味臨床用于治療風濕和類風濕關(guān)節(jié)炎提供了理論支撐。

有證據(jù)表明，PGE2參與關(guān)節(jié)炎病變的發(fā)生發(fā)展。用抗PGE2單克隆抗體中和PGE2能減輕佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的足腫脹和痛覺過敏，也能減少IL-6等炎性因子的分泌［18］。非甾體抗炎藥布洛芬能顯著抑制大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎炎性組織PGE2的分泌，使關(guān)節(jié)腫脹減輕，關(guān)節(jié)疼痛減輕［13］。本實驗用角叉菜膠致大鼠足急性炎癥，炎性組織中PGE2的含量明顯增加。獨一味2種提取物均能使大鼠致炎的局部組織中PGE2的含量較模型組顯著減少，與模型組間比較差異有統(tǒng)計學意義，表明獨一味能抑制炎性組織PGE2的合成(或釋放)，其對類風濕關(guān)節(jié)炎的作用機制可能與非甾體抗炎藥的作用機制有相似之處，即抑制炎性組織PGE2的合成或釋放。獨一味的主要化學成分有黃酮、環(huán)烯醚萜類和苷類，其抗炎作用可能與其所含黃酮成分有關(guān)［19］。而獨一味對佐劑性關(guān)節(jié)炎的作用與哪類化學成分有關(guān)，以及其對佐劑性關(guān)節(jié)炎的確切作用機制還有待進一步的研究。

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