段 婷，張根葆，2，周 兵

(皖南醫(yī)學院 1.病理生理學教研室;2.蛇毒研究所，安徽 蕪湖 241002)

彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)是一種在原發(fā)病基礎(chǔ)上由致病因素誘發(fā)的以凝血功能紊亂為特點的繼發(fā)性綜合征，臨床最常見病因為感染，包括細菌、病毒等感染和敗血癥，且易誘發(fā)多器官功能衰竭，病情兇險，預后較差［1－3］。近年來，蛋白C系統(tǒng)在DIC等危重疾病中的作用受到越來越多臨床醫(yī)師的關(guān)注［4］。最近研究發(fā)現(xiàn)，蛋白C途徑受損引起的活化蛋白C(active protein C，APC)生成減少，將導致凝血功能異常，是多器官功能障礙綜合征的一個重要發(fā)病機制［5］，在DIC的發(fā)生發(fā)展中，血漿PC活性水平下降對疾病的預后具有重要意義，PC活性高低與病死率有密切關(guān)系，對PC活性的持續(xù)監(jiān)測能反映病人的預后和治療效果［6－7］。因此監(jiān)測血漿PC活性水平的變化可用于判斷DIC的發(fā)生、發(fā)展及預后。但目前關(guān)于PC活性在DIC中的連續(xù)變化的研究報道較少，可能與目前PC活性的檢測方法尚未完全統(tǒng)一有關(guān)。目前發(fā)色底物法為國際通用且較為認可的蛋白C活性檢測方法［8］。自 1986 年 Stockear［9－10］等首次發(fā)現(xiàn)并分離出蛇毒PC激活物Protac以來，真正形成商品化的PC活性檢測產(chǎn)品甚少［11］，且進口Protac價格昂貴，使臨床應用受到限制。近年來，皖南醫(yī)學院蛇毒研究所從皖南蝮蛇毒中提取出PC激活組分(PCA)［12］，根據(jù)PC活性檢測原理，研制出發(fā)色底物法PC活性檢測試劑，前期［13］實驗表明能有效激活血漿蛋白C，并與進口Protac生物學活性相似，且應用簡便、結(jié)果穩(wěn)定，特異性強等。

因此，本研究通過建立內(nèi)毒素誘導的DIC家兔模型，采用皖南醫(yī)學院蛇毒研究所研制的蛇毒PC激活劑(PCA)，以發(fā)色底物法檢測DIC時血漿PC的活性變化，觀察血漿PC活性在DIC發(fā)生過程中的變化規(guī)律，以探討PC活性檢測試劑在DIC診斷的應用，為進一步將PC活性檢測試劑應用于基礎(chǔ)研究及臨床診斷提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 健康雄性日本大耳白兔20只，體質(zhì)量1.8～2.2 kg，清潔級，購自江蘇省南京市青龍山動物中心，按實驗動物國家標準喂養(yǎng)，許可證號:2020760。

1.1.2 實驗試劑及儀器 內(nèi)毒素(Escherichia coli 055:B5 LOT2009106):美國 Sigma公司(10 mg/支)。PC激活劑為皖南醫(yī)學院蛇毒研究所制備的凍干粉，－20℃冰箱儲藏備用。凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間 (APTT)和纖維蛋白原(FIB)檢測試劑盒均購于上海太陽生物技術(shù)有限公司。Model-680酶標儀:美國伯樂公司，MC-2000雙通道凝血儀:德國美創(chuàng)公司，低溫高速離心機:北京醫(yī)用離心廠等。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)毒素誘導兔DIC模型的建立 參照Hermida等［14］用 LPS誘導兔 DIC的方法建立動物模型。3%戊巴比妥鈉按1 ml/kg從家兔耳緣靜脈注射麻醉，分離右側(cè)股動脈、插管，以備取血，實驗結(jié)束后結(jié)扎右側(cè)股動脈，縫合皮膚。LPS溶于60 ml生理鹽水中，隨后以100 μg/(kg·h)(10 ml/h)的速度從兔耳緣靜脈滴注給藥，連續(xù)6 h，給藥后根據(jù)兔麻醉深度可適當給予戊巴比妥鈉腹腔注射，以維持動物的持續(xù)麻醉狀態(tài)，建立穩(wěn)定的兔DIC模型。

1.2.2 動物分組 新進雄兔在動物室飼養(yǎng)1周，給予清潔的水和食物，使之適應環(huán)境。符合實驗標準的雄兔20只，隨機分為生理鹽水(NS)對照組和內(nèi)毒素(LPS)組，每組10只。

1.2.3 給藥方法

1.2.3.1 生理鹽水(NS)對照組 從兔雙側(cè)耳緣靜脈以10 ml/h的速度滴注生理鹽水，連續(xù)給藥6 h。

1.2.3.2 DIC 模型組 在兔一側(cè)耳緣靜脈滴注100 μg/(kg·h)(10 ml/h)LPS 的同時，從對側(cè)耳緣靜脈以10 ml/h的速度滴注生理鹽水，連續(xù)給藥6 h。

1.3 樣本采集和處理 各組均在靜脈滴注1 h、2 h、3 h、4 h、6 h 時分別從股動脈取血 1 ml，以3.8%枸櫞酸鈉(1∶9)抗凝，3 000 r/min離心 10 min，分離血漿，抽取100 μl血漿，－20℃冰凍保存待測;余血漿檢測凝血功能各指標，2 h內(nèi)檢測完畢。從給藥開始，記錄實驗動物的24 h生存率，24 h內(nèi)死亡的動物即時解剖，取肺，肝，腎做病理切片。24 h觀察期結(jié)束后，將各組存活動物處死、解剖，取主要臟器做病理切片。

1.4 蛋白C(PC)測定原理 血漿PC活性測定為發(fā)色底物法，原理［15］:Protac(一種蛇毒提取物)能特異性地激活PC，使PC轉(zhuǎn)化為活化蛋白C(APC)，APC作用于發(fā)色底物Chromozym-P，釋放出產(chǎn)色基團對硝基苯胺(PNA)，產(chǎn)色深淺與 APC呈線性關(guān)系。

1.5 數(shù)據(jù)處理 使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。兩組間比較采用t檢驗，各組不同時點比較采用F檢驗。

2 結(jié)果

2.1 日本雄性大耳白兔注射內(nèi)毒素后情況及24 h病死率 正常對照組兔:精神狀態(tài)良好，毛色光澤，反應靈敏，進食正常，睡眠尚可，24 h觀察期內(nèi)無死亡例數(shù)。LPS實驗組兔:注射內(nèi)毒素后，精神萎靡，反應遲鈍，拱背蜷臥，毛色光澤差，呼吸急促，寒戰(zhàn)，腹瀉，口周發(fā)紺。LPS實驗組上述癥狀持續(xù)10 h，10 h時全組死亡5只，24 h時共死亡8只，病死率80%。

2.2 LPS實驗組凝血指標與NS對照組比較 從表1可見，LPS實驗組滴注LPS 2 h時，APTT開始延長，為(20.87 ±2.02)s，與 NS組比較有差異(P ＜0.05);4 h、6 h 時 APTT 值明顯延長，分別為(24.60±2.36)s、(30.29 ±2.17)s，與 NS 組比較有顯著差異(P ＜0.05)。同時PT 值也延長，在4 h、6 h時，分別為(11.23 ±2.18)s、(12.8 ±2.81)s，與 NS 組比較差異顯著(P＜0.05)。而FIB值在滴注LPS后持續(xù)下降，在 4 h、6 h 時，分別為(2.37 ±0.31)g/L、(1.72±0.08)g/L，與 NS 組比較差異顯著(P ＜0.05)。

表1 DIC模型組凝血指標與NS對照組比較(±s，n=10)Tab 1Comparison of the coagulation indicators between DIC model group and NS group(±s，n=10)

表1 DIC模型組凝血指標與NS對照組比較(±s，n=10)Tab 1Comparison of the coagulation indicators between DIC model group and NS group(±s，n=10)

PT:凝血酶原時間;APTT:活化部分凝血活酶時間;FIB:纖維蛋白原

指標 組別 時間(h)1 2 3 4 F P＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 87 ＜0.05 LPS 組 8.74 ±0.97 9.61 ±1.87 11.23 ±2.18 12.80 ±2.81 7.551 ＜0.05 t 1.625 1.710 4.009 4.492 P＞0.05 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 APTT(s)NS 組 15.32 ±0.23 15.53 ±0.21 16.69 ±0.44 16.96 ±0.89 24.826 ＜0.05 LPS 組 16.21 ±0.88 20.87 ±2.02 24.60 ±2.36 30.29 ±2.17 93.696 ＜0.05 t 3.094 8.315 10.419 17.973 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 FIB(g/L)NS 組 4.12 ±0.19 4.00 ±0.13 3.90 ±0.10 3.88 ±0.08 6.974 ＜0.05 LPS 組 3.97 ±0.6 3.50 ±0.09 2.37 ±0.31 1.72 ±0.08 90.035 ＜0.05 t 0.754 10.001 14.854 60.374 P PT(s)NS 組 8.23 ±0.21 8.58 ±0.36 8.44 ±0.30 8.76 ±0.44 4.3

2.3 LPS實驗組血漿蛋白C活性指標變化與NS對照組比較 從表2可見:LPS實驗組靜脈滴注LPS 1 h后，日本雄性大耳白兔的PC活性為(72.57±10.6)%，較 NS組下降明顯(P ＜0.05)。提示蛋白C系統(tǒng)受影響，血漿PC活性已開始下降。LPS輸注2 h、3 h，PC 活性持續(xù)下降，分別為(67.48±7.27)%、(61.17 ±9.25)%，較 NS 組下降更明顯(P＜0.05)，提示血漿PC活性下降的程度與DIC的發(fā)展相關(guān)。在LPS滴注6 h時，PC活性下降到最低點，為(52.97±5.87)%，與 NS組比較差異顯著(P＜0.05)。提示蛋白C系統(tǒng)受影響程度與機體DIC的發(fā)展程度有密切關(guān)系。

表2 LPS實驗組蛋白C(PC)活性指標變化與NS對照組比較(±s，n=10)Tab 2 Comparison of PC activity between DIC model group and NS group(±s，n=10)

表2 LPS實驗組蛋白C(PC)活性指標變化與NS對照組比較(±s，n=10)Tab 2 Comparison of PC activity between DIC model group and NS group(±s，n=10)

時間(h)NS組PC活性(%)LPS組PC活性(%)t P 1 h 102.76 ±10.47 72.57 ±10.6 6.408 ＜0.05 2 h 99.08 ±9.97 67.48 ±7.27 8.099 ＜0.05 3 h 97.48 ±11.43 61.17 ±9.25 7.809 ＜0.05 4 h 99.80 ±6.91 58.42 ±6.72 13.576 ＜0.05 6 h 98.20 ±6.26 52.97 ±5.87 16.667 ＜0.05

2.4 肝、腎、肺病理改變 肝臟:LPS實驗組鏡下可見肝細胞廣泛水腫，無壞死，部分肝細胞出現(xiàn)脂肪變，肝竇擴張，中央靜脈擴張，匯管區(qū)小葉間靜脈充血較明顯(見圖1B)。腎臟:LPS實驗組鏡下可見腎間質(zhì)血管擴張充血較明顯，小管上皮細胞廣泛水腫，無壞死，腎小球形態(tài)無特殊，微血管內(nèi)易見纖維蛋白微血栓形成(見圖1D)。肺臟:LPS實驗組鏡下可見肺間質(zhì)血管擴張充血明顯，肺泡間隔明顯增寬，肺間質(zhì)內(nèi)可見大量炎性細胞浸潤，部分肺泡腔內(nèi)可見炎細胞滲出，部分可見灶性出血及微血栓形成(見圖1F)。

3 討論

內(nèi)皮細胞的炎癥損傷是感染所致DIC發(fā)生發(fā)展過程的突出特點，并對PC抗凝系統(tǒng)產(chǎn)生影響，持續(xù)監(jiān)測PC活性能反映病人的預后和治療效果［9－10］。但目前關(guān)于PC活性在DIC中連續(xù)變化的研究報道較少，且國內(nèi)也尚無類似Protac的PC活性檢測試劑商品面世。

本實驗用連續(xù)靜脈滴注LPS誘導兔DIC發(fā)生的方法建立動物模型，結(jié)果顯示，給予LPS后，F(xiàn)IB值呈顯著降低，PT值、APTT值呈進行性升高，病理切片肝、腎、肺組織出現(xiàn)損傷改變及微血管中纖維蛋白微血栓形成等，確認了用LPS誘導兔DIC模型造模成功。實驗結(jié)果顯示，LPS組給予LPS靜脈滴注1 h時，PC系統(tǒng)即有明顯受抑的表現(xiàn)，PC活性出現(xiàn)下降，明顯低于正常對照組，而此時 APTT、PT與FIB尚未出現(xiàn)明顯異常。LPS靜脈滴注2 h時，APTT、PT才開始延長，F(xiàn)IB才開始下降，PC活性則繼續(xù)下降，提示PC活性指標異常比凝血指標出現(xiàn)得更早，更敏感。隨著LPS持續(xù)滴注和DIC進展，APTT、PT進行性延長，F(xiàn)IB與 PC活性持續(xù)下降。LPS靜脈滴注6 h時PC活性下降到最低，提示PC活性受損程度與DIC的發(fā)生、發(fā)展程度密切相關(guān)。因此，檢測血漿PC活性及變化趨勢對DIC的早期預測、診斷及預后具有重要的臨床應用意義和價值。

圖1 DIC實驗組病理組織圖片(HE×40)A:NS對照組肝組織正常;B:DIC實驗組肝組織，部分肝細胞出現(xiàn)脂肪變;C:NS對照組腎組織正常;D:DIC實驗組腎組織，箭頭顯示腎微血管中的纖維蛋白微血栓;E:NS對照組肺組織正常;F:DIC實驗組肺組織，箭頭顯示肺微血管中的纖維蛋白微血栓Fig 1 Pathological sections from DIC models and NS group(HE×40)A:Indicating the normal liver tissue from the control group;B:Liver tissue from the DIC group shows partial adipose degeneration;C:Suggesting normal kidney tissue in the control group;D:Kidney tissue in the DIC group indicates microvascular fibrin micro-thrombosis as shown by the arrow;E:Normal lung tissue for the control group;F:Lung tissue in the DIC group presents with microvascular fibrin micro-thrombosis as shown by the arrow

目前，PC的檢測方法主要有活化部分凝血活酶時間(APTT)法、抗原測定法及發(fā)色底物法(CSA)。CSA采用比較特異性的發(fā)色底物，操作簡便易行，結(jié)果準確且重復性好［16－17］，所以通常采用 ELISA 法或發(fā)色底物法［18］。世界衛(wèi)生組織(World Health Orgnization，WHO)亦推薦CSA為PC的檢測方法。目前臨床上對DIC的早期預測、診斷及預后價值的指標并不多，PC活性的連續(xù)監(jiān)測有望成為其預測、診斷及預后的參考指標。本研究提示PC活性檢測試劑具有良好的應用及科研前景。

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